大鼠肾脏5/6切除microRNA-483-3p的表达变化及机制*

尚粉青 顾文娟 郭瑄 王兰 韩媛 宁明安

(西北大学附属第一医院·西安市第一医院心血管内科，陕西 西安 710002)

慢性肾衰竭是各种肾病持续发展的最终结局，严重危害人类健康。而慢性肾病发展过程中最重要的病理改变为肾脏纤维化，有效延缓或逆转肾纤维化进程可延缓慢性肾病进展。目前发现有多种microRNA参与肾脏疾病的发生及发展。研究证实，慢性肾病发展过程中microRNA-92a(miR-92a)升高[1]，阿托伐他汀可以降低miR-92a的表达,延缓慢性肾病进展[2]。miR-483-3p既往在多种肿瘤发病过程中有系列研究[3-5]，近年研究结果提示miR-483-3p对肝细胞纤维化[6]、肺动脉高压[7]具有显著抑制作用，对结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF)]8]、转化生长因子(transforming growth factor, TGF-β)及EGFR/PTEN(epidermal growth factor receptor/Phosphatase and tensin homolog)信号通路[9]、DPC4/Smad4及AANAT(arylalkylamine N-acetyltransferase)[10]等纤维化相关因子均有调节作用。本研究主要探讨在慢性肾病发病过程中miR-483-3p的表达变化及其作用机制，并进一步研究过表达miR-483-3p是否可延缓慢性肾病发展。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及仪器 miR-483-3p Agomir购自广州市锐博生物科技有限公司。主要试剂：PCR引物(miR-483-3p、CTGF、PTEN等)：生工(上海)有限公司合成。β-actin抗体购自Santa Cruz公司；CTGF抗体、PTEN抗体购自美国Cell Signaling公司。Trizol 试剂(Invitrogen公司)，HiScriptTMqPCR SuperMix逆转录试剂盒(Vazyme公司)，PCR DNA聚合酶(Vazyme公司)，其余试剂为国产分析纯。主要仪器：实时定量PCR仪及梯度PCR仪(美国Applied Biosystems 公司)，WB电泳仪和电泳槽、WB半干转膜槽(BIO-RAD公司)，自动洗片机(柯达公司)。

1.2 大鼠5/6肾切除慢性肾衰模型[11]的建立 选用36只8～10周龄雄性SD大鼠作为研究对象，购自西安交通大学实验动物中心，清洁级别：SPF级；所有实验操作均得到西安市第一医院实验动物伦理委员会审批批准。所有大鼠均在室温24℃，12小时光照，12小时黑暗，充足水供和饲料。随机分为2组：A组:假手术组(12只)；B组：5/6肾切除(24只)。二步法建立5/6肾切除模型，以20%的乌拉坦(0.6mL/100g)腹腔注射麻醉后，仰卧固定在手术台上，局部剪毛，右侧腹直肌外缘常规消毒，无菌操作下垂直切口开腹，长约3cm，暴露右肾，分离固定，按上极、下极弧形切右肾组织，主要切皮质，用喷有凝血酶的凝胶海绵压迫止血，待血止后缝合包扎，切除的右肾组织只是约占一侧肾脏皮质的2/3。术后24小时手术组死亡2只。术后2周再次手术，同样方案麻醉，切开左侧腹部皮肤，暴露左肾，结扎肾蒂，切除左肾。假手术组制备方法：同样方法麻醉及开腹，不切除肾脏，分离肾周膜，保留肾上腺即关腹。

1.3 动物分组及处理 36只SD大鼠适应环境1周，手术造模，随机分成对照组(假手术组，12只)及模型组(5/6肾切除组，24只)。24只随机分成2组：模型组(5/6肾切除组，12只)；miR-483-3p过表达组(5/6肾切除+miR-483-3p Agomir，12只)。miR-483-3p Agomir给予60mg/kg尾静脉注射，每2周1次。对照组和模型组每2周给予等量的生理盐水尾静脉注射。大鼠自由进食、饮水。术后8周处死动物，留取标本。

1.4 标本的采集 处死大鼠前一天，将大鼠置金属代谢笼,留取24小时尿液。处死大鼠当天用10%水合氯醛麻醉大鼠，取腹腔正中切口，经腹主动脉采血，提取血清，测定血生化。分别称重3组肾脏质量，剩余的大部分组织分成1cm3大小置-80℃冰箱保存，用于分子生物学研究。

1.5 血清各项指标的测定 采用血自动生化仪测定血尿素氮、肌酐、胆固醇、甘油三脂、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及高敏C反应蛋白。测定24小时尿蛋白定量。

1.6 肾脏组织各项指标的测定 取肾脏组织50mg，剪碎，加入Trizol 1mL超声匀浆，提取肾脏组织RNA，RT-PCR方法测定肾脏组织中miR-483-3p、CTGF、TGF-β、EGFR/PTEN、DPC4/Smad4及AANAT的含量。PCR引物序列(见表1)。取肾脏组织80mg/只，剪碎组织，加入蛋白裂解液约300mL，匀浆机匀浆，3次，每次30s；液氮冻融3次，4℃，12000r/min，离心15min，取上清，ABC法测定蛋白浓度。Western Blot方法测定肾脏组织中蛋白表达的变化。

表1 实时定量PCR引物列表

2 结果

2.1 血清中一般生化指标及24小时尿蛋白定量 与正常对照组相比，模型组尿素氮(BUN)(t=21.13，P<0.05)和肌酐(Cr)(t=14.38，P<0.05)明显升高，血浆总胆固醇(TC)(t=8.136，P<0.05)及低密度脂蛋白(LDL-C)(t=5.404，P<0.05)亦显著升高。miR-483-3p Agomir干预组与模型组比较，尿素氮(t=4.105，P=0.0011)和肌酐(t=4.207，P=0.0009)明显降低，两组比较差异有统计学意义。但血脂水平在治疗前后无明显变化(TC：t=0.6759，P=0.5101；LDL-C：t=1.476，P=0.1620)。炎症指标hs-CRP(t=4.775，P=0.0003)及24小时尿蛋白定量(t=26.04，P<0.05)在模型组明显升高，miR-483-3p Agomir干预组较模型组显著降低(hs-CRP：t=2.435，P=0.0294；24h Urine protein：t=4.863，P=0.0003)，见表2。

表2 三组血清生化指标的比较

2.2 肾脏组织中miR-483-3p下游靶基因变化预测 RT-PCR检测预测miR-483-3p的下游靶基因CTGF、TGF-β、EGFR/PTEN、DPC4/Smad4及AANAT的含量变化，结果显示与对照组相比，模型组肾脏组织中CTGF(t=4.313，P=0.00028)和EGFR/PTEN(t=3.590，P=0.00163)表达显著升高，而TGF-β(t=1.559，P=0.133368)、DPC4/Smad4(t=0.2071，P=0.83780)及AANAT(t=0.4071，P<0.68783)无明显变化，见图1。提示在大鼠5/6肾切除导致的肾功能不全病理进展过程中CTGF和EGFR/PTEN起重要作用。

图1 肾脏miR-483-3p下游靶基因表达变化预测

2.3 三组大鼠肾脏miR-483-3p及CTGF、PTEN表达变化情况 与对照组相比，模型组肾脏组织中miR-483-3p的表达明显升高(t=7.335，P<0.05)，miR-483-3p Agomir干预组肾脏组织miR-483-3p的表达升高更显著(t=11.35，P<0.05)；模型组肾脏组织中CTGF(t=5.667，P<0.05)和EGFR/PTEN(t=3.393，P=0.00261)表达显著升高，miR-483-3p Agomir干预组较模型组表达显著降低，见图2。

图2 三组大鼠肾脏miR-483-3p及下游靶基因表达变化

2.4 miR-483-3p上游宿主基因IGF-2的表达变化 与对照组相比，模型组肾脏组织中IGF-2的表达明显升高(t=3.905，P=0.0008)，miR-483-3p Agomir干预组肾脏组织IGF-2的表达较模型组表达显著降低(t=3.101，P=0.0056)，见图3。

图3 三组大鼠肾脏IGF-2表达变化

3 讨论

随着microRNA在慢性肾病中的研究日益深入,已发现有多种microRNA参与肾脏疾病的发生及发展[12-14]。我们前期研究发现miR-92a在肾功能损伤的进展过程中起重要作用，而阿托伐他汀等药物通过降低miR-92a表达可有效缓解肾脏损伤。近来有研究显示，miR-483有明确的抗纤维化作用，对多条纤维化信号通路均有抑制作用[8-10]。miR-483-3p是由胰岛素样生长因子-2(insulin-like growth factor 2，IGF-2)第二内含子上的一段区域转录剪切形成的，最早被发现在人类肝脏中，除此之外还存在于皮肤、肾脏、脂肪等多种组织器官中[15]。目前已有许多研究围绕miR-483展开。已被发现的miR-483的靶基因包括EGFR/PTEN/AKT信号通路，DPC4/Smad4(3p)，ERK1(5p)，AANAT，CTGF。这些分子在细胞的生长、增殖及迁移过程中均有重要的作用。因此，miR-483存在着广泛的生理与病理学意义。除此之外，多种肿瘤细胞研究亦证明miR-483有抑制肿瘤细胞增殖迁移的作用[16-19]。miR-483过表达的小鼠还有一定抗肝纤维化的表现[6]。

本研究我们证实了5/6肾切除模型慢性肾纤维化大鼠的造模成功，血BUN、Cr及24小时尿蛋白定量均显著增加。miR-483-3p Agomir干预组血BUN、Cr及24小时尿蛋白定量较模型组显著降低，证实了过表达miR-483-3p对肾脏纤维化的治疗作用。我们进一步探讨miR-483-3p对肾脏的保护作用是通过作用于哪些靶基因，检测了CTGF、TGF-β、EGFR/PTEN、DPC4/Smad4及AANAT的表达，结果显示CTGF和PTEN表达显著升高，而TGF-β、DPC4/Smad4及AANAT无明显变化。大量研究已证实CTGF[20]及PTEN[21-22]在慢性肾纤维化过程中的重要作用。本研究进一步证实miR-483-3p Agomir干预组CTGF和PTEN表达较模型组显著降低。同时，对于miR-483-3p的宿主基因IGF-2的表达情况，研究结果显示模型组IGF-2显著增加，而miR-483-3p Agomir干预组较模型组有降低趋势。

我们认为在肾脏疾病发展初期，随着IGF-2表达，增加内皮细胞miR-483-3p表达，抑制其靶基因CTGF、PTEN等表达，减少细胞外基质胶原蛋白、黏连蛋白等表达，以延缓肾脏纤维化的发展；同时miR-483-3p反馈抑制IGF-2/miR-483表达[8]，从而使miR-483的表达不能显著增加来拮抗肾脏纤维化的病理发展；而随着肾脏损伤加重，miR-483-3p表达下降，使其无法发挥肾脏保护作用，肾纤维化进一步加重。通过尾静脉注射外源性补充富含miR-483-3p的外泌体，使其肾脏组织有足够的miR-483-3p来有效延缓肾脏纤维化进展。

本研究结果提示在5/6肾切除模型大鼠肾脏中过表达miR-483-3p作用于其靶基因CTGF/PTEN来延缓肾脏病的发展。此方面的探讨为我们进一步研究microRNA与肾脏疾病关系提供了理论依据。但本研究局限之处在于没有对miR-483-3p下游的靶基因进行系统的筛查从而得到更完善的作用机制，今后我们将继续这方面研究。

4 结论

在慢性肾脏疾病发展过程中，随着IGF-2表达增加，miR-483-3p表达亦增加。miR-483-3p可反馈抑制其宿主基因IGF-2的表达，同时通过抑制其靶基因CTGF、PTEN的表达，可延缓肾脏纤维化过程。