人呼吸道合胞体病毒疫苗的研究进展

刘建东，张静飞 综述，刘建凯，郑海发审校

北京民海生物科技有限公司结合疫苗新技术研究北京市重点实验室，北京 102600

人呼吸道合胞体病毒（respiratory syncytial virus，RSV）为一种副黏病毒科肺病毒属的有囊膜、非节段性的单股负链RNA病毒，是导致全球婴幼儿细支气管炎及肺炎的主要致病原，6月以下婴儿感染RSV的风险最高，RSV也可导致老人及免疫缺陷人群发生严重的呼吸道疾病，主要症状为发热、咳嗽、鼻炎及呼吸困难［1］。RSV每年导致全球约3.3亿病例感染，其中约20%患者需住院治疗，16万 ～19万死亡，造成严重的社会负担。RSV具有高度传染性，主要通过感染者的体液分泌物进行传播，勤洗手和远离感染者是最好的预防措施。RSV于1955年首次从感冒症状的黑猩猩体内分离获得，1956年在患有细支气管炎的儿童体内分离到RSV［2］。RSV仅有1个血清型，A和B两个亚型，基因组长15 200，编码11种蛋白，包括黏附蛋白（G）、小疏水蛋白（SH）、融合蛋白（F）、核衣壳蛋白（N）、磷蛋白（P）、聚合酶及基质蛋白（M1、M2-1、M2-2）等9个结构蛋白和2个非结构蛋白NS1、NS2，其中F、G及N蛋白是疫苗研究的主要靶抗原［3］。

一种安全有效的RSV疫苗对预防病毒传播具有极其重要的作用，本文就RSV免疫逃逸机制及其疫苗的研究进展作一综述。

1 RSV免疫逃逸机制

RSV被发现已超60年，但目前仍无上市的RSV疫苗来预防RSV感染。主要原因是RSV通过进化形成了多种免疫逃逸机制：①RSV感染的是呼吸道浅层上皮细胞。通过这种感染方式可避免或推迟病毒暴露于树突状细胞，暴露于树突状细胞在抗原诱导适应性免疫反应过程中具有至关重要的作用[4-5］。②RSV可隐藏中和抗体表位。F蛋白在病毒与宿主融合的过程中具有重要作用，也是RSV诱导中和抗体反应的主要免疫原，融合前F蛋白不稳定，融合过程中会发生结构改变，形成融合后的F蛋白，该蛋白结构非常稳定。相比于融合后F蛋白，融合前F蛋白能诱导更强的中和抗体反应。通过改变F蛋白的结构，RSV可逃避融合前蛋白诱导的中和抗体的杀伤［6］。③RSV调节宿主的免疫反应。RSV主要感染人群为婴儿，婴儿的免疫系统尚不完善，树突状细胞不成熟，B细胞体细胞突变具有缺陷，RSV感染可导致Th2细胞偏好性的免疫反应［7-9］。此外，病毒能通过NS1及NS2蛋白抑制感染的上皮细胞释放Ⅰ型IFN，通过G蛋白调节树突状细胞的信号转导，还可通过分泌形式的G蛋白掩盖抗体的中和能力［10-12］。

2 RSV疫苗

1966年开展了首个RSV疫苗的临床试验。研究者使用福尔马林灭活的RSV病毒（FI-RSV）作为疫苗，免疫了20名2～7月龄婴儿，结果显示，疫苗不仅不能产生足够的中和抗体抵抗感染，且还使16名婴儿引发了更严重的肺炎及细支气管炎而住院，其中2名婴儿在感染RSV后导致死亡［13］。病毒不能启动免疫记忆反应是RSV预防类疫苗无效的主要原因，随着FI-RSV疫苗的失败，研究者开始开发其他类型RSV疫苗，主要包括弱毒活疫苗、嵌合体疫苗、亚单位疫苗、病毒样颗粒疫苗及纳米颗粒疫苗。正在进行临床试验的RSV疫苗见表1。

表1 正在进行临床试验的RSV疫苗Tab.1 RSV vaccines in clinical trial

2.1 减毒活疫苗 最初研究的RSV减毒活疫苗是通过在体外26℃连续传代制备的，相比于福尔马林灭活的RSV疫苗，减毒活疫苗暴露于天然RSV感染后不会导致疾病增强现象［14］。对于弱毒活疫苗，需在弱化的病毒复制与诱导有效的免疫反应中维持平衡。近来研究显示，移除G蛋白的CX3C基序，可通过将增强呼吸道疾病相关性的Th2型细胞反应转变为Th1型细胞反应来增强病毒的安全性，但这种基因弱化的减毒活疫苗在选择压力下能否保持还有待研究［15］。另一种候选的减毒活疫苗OE5是将NS1、NS2及G蛋白进行部分优化，同时完全去除SH蛋白，这种方法产生的减毒活疫苗较好的限制了病毒复制，且保留了诱导最强中和抗体的F蛋白完整性［16］。在一项小鼠实验中显示，OE5可在感染RSV后，诱导持续100 d的保护性抗体反应，且不导致增强呼吸道疾病反应。因此，减毒活疫苗OE5为一种较有潜力的安全有效的候选疫苗［16］。

2.2 嵌合病毒疫苗 减毒活疫苗一个缺点是自然感染RSV不能产生持久的保护性免疫记忆反应，在F及G蛋白上的多种表位可被适应性免疫反应识别，但随着病毒的清除，保护性反应消逝，婴儿可被相同亚型的RSV连续感染，为克服这种困难，许多研究团队研制了表达RSV蛋白的重组嵌合体。有研究者构建了表达RSV N蛋白的卡介苗（Bacillus Calmette Guerin vaccine，BCG），BCG 为一种从牛分支杆菌分离的用于预防结核的疫苗，可诱导持久的T细胞免疫反应，研究显示，该疫苗可有效刺激CD4+和CD8+细胞免疫反应，在小鼠实验中可预防RSV的感染［17］。另一项研究是利用仙台病毒作为载体，构建RSV嵌合体，仙台病毒属副黏病毒科，主要感染小鼠及啮齿类动物，研究者利用复制缺陷的仙台病毒作为疫苗骨架，用RSV的F蛋白取代仙台病毒的F蛋白，这种嵌合体疫苗可通过鼻内黏膜免疫及肌肉免疫诱导T细胞和抗体免疫反应［18］。最有前景的嵌合体疫苗是副流感病毒5型（parainfluenza virus 5，PIV5）与RSV的嵌合体，副流感病毒是导致儿童感染重要的呼吸道病原体。用表达RSV F或G蛋白的两种PIV5嵌合体接种棉鼠及非洲绿猴，结果显示，两种嵌合体均能保护动物免受感染，其中在非洲绿猴试验中，表达F蛋白的PIV5嵌合体比表达G蛋白的PIV5嵌合体诱导更高水平的抗体滴度［19］。基因稳定性研究显示，嵌合体疫苗在体内及体外的传代过程中会发生随机突变，这种基因不稳定性可能是RNA嵌合体疫苗的一个最大担忧，进一步研究发现，将RSV的F蛋白插入至PIV5的HN和L基因之间是稳定的［20］。一种改进表达稳定融合前F蛋白的PIV5嵌合体疫苗，在小鼠试验中能诱导与自然感染野生型RSV相似的中和抗体反应，并能在RSV攻毒实验中提供免疫保护［21］。

2.3 亚单位疫苗 亚单位疫苗的优点是可产生对病毒蛋白的免疫记忆而不导入活病原体或造成增强呼吸道疾病的风险。近年来，在棉鼠模型中研究发现，低免疫剂量RSV的F蛋白会导致增强呼吸道疾病，而高免疫剂量却不会，这增加了人们对免疫剂量在免疫人群安全性的担忧［22］。基于此，靶向特异表位的亚单位疫苗是RSV疫苗研究的一个全新的方向。在一项研究中，以poly IC（双链RNA的合成类似物）为佐剂的RSV F蛋白多肽单次经鼻内黏膜免疫小鼠，能产生持续150 d的免疫保护［23］。另一项研究用脂质体核心多肽免疫BALB／c小鼠，虽产生了很强的抗体免疫反应，但这些抗体不能结合天然RSV的F蛋白，更不能产生任何的免疫保护［24］。这些研究表明，对于亚单位疫苗，攻毒实验检测免疫保护比检测抗体滴度更加重要。RSV的G蛋白是另一个能诱导产生保护性免疫反应的疫苗候选抗原，未糖基化的G蛋白不会导致增强的呼吸道疾病，可产生对RSV的免疫保护。研发RSV疫苗的另一种担忧是毒株差异的问题，因实验室研究常用RSV A2毒株，该毒株为实验室适应株，而婴儿感染的毒株可能是一些不同的毒株，这需要研发的疫苗可提供对不同亚型毒株均具有免疫保护反应［25］。研究者通过构建结合A和B亚型RSV的G蛋白疫苗，动物实验结果显示，该疫苗可产生针对两种亚型的很强的体液免疫反应［26］。

2.4 病毒样颗粒（virus like particle，VLP）疫苗 VLP是不含任何基因物质、具有复制缺陷、能自我组装的病毒蛋白。研究者用流感病毒的M1蛋白及RSV的F蛋白或G蛋白构建VLP疫苗，两种疫苗均能产生RSV特异的抗体免疫反应，在小鼠模型中也能保护小鼠不受RSV感染［27］。各种类型的VLP疫苗均能诱导产生Th1型的细胞免疫反应，现阶段对于使用融合前F蛋白还是融合后F蛋白构建VLP疫苗还有待研究，尽管融合前F蛋白VLP疫苗能产生更高水平的中和抗体反应，但融合后F蛋白VLP疫苗可产生更高的Th1型免疫反应，产生更高占比的IgG2a抗体［28］。在活RSV（A2毒株）攻毒实验中，VLP疫苗免疫小鼠比未免疫小鼠具有更高的免疫保护，但不比前期感染活RSV小鼠的免疫保护高，今后需进一步改进来增强VLP疫苗的保护效果［29］。

2.5 微米或纳米颗粒疫苗 微米或纳米颗粒的大小影响抗原呈递至引流淋巴结的方式，小的纳米颗粒（2～200 nm）可轻易引流至淋巴结，大的纳米颗粒（＞500 nm）需由树突状细胞吞噬，这种被抗原提呈细胞吞噬使大的纳米颗粒比小的在淋巴结中保留更长的时间［30］。一种靶向RSV N蛋白的纳米颗粒疫苗临床前研究显示，该疫苗可在小鼠及猪体内诱导产生保护性的CD4+T细胞免疫反应［31］。另一种RSV F蛋白的纳米颗粒疫苗已进入Ⅱ期临床试验，目标人群为成年女性，结果显示，疫苗对RSV感染者具有50%的保护效果，发展前景较好，但还需在目标感染人群中进一步检测；为了将产生的抗体通过胎盘传给胎儿，保护1月龄的胎儿，Ⅲ期临床计划免疫妊娠晚期的孕妇；另外，感染RSV的母亲也有57%概率将病毒传染给胎儿，免疫母亲可通过产生母源抗体保护其婴儿；目前该疫苗Ⅲ期临床试验正在进行中［32］。上述RSV F蛋白的纳米颗粒疫苗对老年人的临床实验也在进行中，结果显示，疫苗安全性较好，受试者在接种12个月后，仍具有较高的抗体滴度，在Ⅱ期临床实验中需检测这些抗体反应是否可为老年人提供免疫保护［33］。

3 小结

RSV是导致婴儿发病及死亡的一个主要病原，对医疗系统造成严重的经济负担。近年来，研究者始终在研发各种可有效预防RSV传播的疫苗，但因RSV自然感染不能诱导针对保守免疫原的长期免疫记忆反应，以及前期临床实验一些候选疫苗会造成呼吸疾病增强等原因，现阶段还无上市RSV疫苗可用。随着近年来技术的不断发展，一些新型的疫苗已在临床实验中显示具有很好的安全性和有效性，相信在不久的将来，能成功研发出可在婴儿和其他目标人群有效预防RSV感染的疫苗。