以溶血素为抗原的新型肺炎球菌疫苗的研究进展

刘宗华 综述，薛巍 审校

暨南大学生命科学技术学院生物医学工程系，广东 广州 510632

肺炎球菌是人类最常见的细菌性病原微生物之一，是引起肺炎、脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎和菌血症等的主要病原体。据统计，全球每年约119万人死于肺炎球菌感染，其中，主要为5岁以下儿童，且90%以上病例发生在发展中国家和欠发达国家［1-2］。儿童肺炎球菌感染已成为世界范围内严重的公共卫生问题。目前，肺炎球菌感染的临床治疗措施主要为抗生素治疗，但抗生素的广泛应用使肺炎球菌的耐药性问题日益严重。

针对肺炎球菌的感染和传播，优选方案是采用肺炎球菌疫苗进行提前预防。目前已上市的两种肺炎球菌疫苗是基于肺炎球菌荚膜多糖所开发的23价肺炎球菌多糖疫苗（23-valent pneumococcus polysaccharide vaccine，PPV23）和13价肺炎球菌结合疫苗（13-valent pneumococcus conjugate vaccine，PCV13）［3］。在欧美等发达国家，这两种疫苗的广泛使用在很大程度上降低了肺炎球菌感染疾病的发生，取得了良好的疾病预防效果。但这两种疫苗仍存在制备成本高、血清型覆盖率有限等局限性。此外，PPV23缺乏对2岁以下婴幼儿的免疫原性［4］。PCV13克服了PPV23的许多局限性，但不能预防所有血清型的肺炎球菌感染，且存在“血清型替代”问题，即非疫苗血清型的扩张，这是由于从接种人群中剔除了与之竞争的疫苗血清型，而使其能够定植宿主［5］。

为了克服上述传统多糖疫苗的局限性，急需开发广谱的新型肺炎球菌疫苗，以对更广泛的肺炎球菌菌株提供更经济的保护［6］。目前，新型肺炎球菌疫苗的开发主要聚焦于蛋白疫苗、全细胞疫苗、DNA疫苗等［7］。由于在不同血清型菌株间高度的保守性，蛋白抗原成为新型肺炎球菌疫苗开发的重要突破口［8］。其中，已处于研究阶段的肺炎球菌蛋白疫苗的候选抗原蛋白包括溶血素、肺炎球菌表面蛋白A（pneumococcal surface protein A，PspA）和 PspC、肺炎球菌表面黏附素A（pneumococcal surface adhesion A，PsaA）、依赖于ATP的酪蛋白溶解蛋白酶（ATP-dependent caseinolytic protease，ClpP）、假定脂肪酸蛋白连接酶（putative lipoate-protein ligase，Lpl）、胆碱结合蛋白 A（choline binding protein A，CbpA）等［9］。研究表明，所有肺炎球菌血清型均含这些候选抗原蛋白，可提供对肺炎球菌的有力保护［10］。本文对以溶血素为抗原蛋白的新型肺炎球菌疫苗的研究进展作一综述。

1 肺炎球菌溶血素的结构及生物活性

溶血素是肺炎球菌主要的蛋白质毒力因子［11-12］，属于结合胆固醇并在细胞膜上打孔的细菌毒素家族［13-15］。目前已知的97种肺炎球菌血清型几乎均产生溶血素［16］。溶血素分子含471个氨基酸，相对分子质量为53 000，含4个不同的结构域［17-18］：结构域1、2、3维持溶血素分子的稳定性；而结构域4（包括氨基酸残基序列360-469）为该蛋白的C-末端序列，促进对靶细胞膜上胆固醇的结合，再在靶细胞膜疏水结合区域形成孔结构。多个毒素单体聚集起来，组装成圆形的前孔结构，经过一系列构象转变，形成β-圆桶型的穿膜孔，直径为35 nm，每个孔含50个溶血素单体分子［19］。溶血素的靶向治疗是增强肺炎球菌相关疾病疗效的有利策略［20］。其中以溶血素为蛋白抗原开发的新型肺炎球菌疫苗［21］，能够克服传统多糖疫苗“血清型替代”的局限性，有广泛的肺炎球菌血清型覆盖率，具有极为重要的临床应用价值以及重大的社会和经济效益。

作为一种候选抗原，溶血素会在哺乳动物细胞膜上打孔而导致细胞坏死，其具有很大的细胞毒性，在很大程度上限制了其作为蛋白抗原的肺炎球菌疫苗的开发。理想的疫苗候选抗原应具备特异性、保守性、低毒性、能够定位于病原表面等特征。30年前，溶血素即已被考虑作为疫苗抗原，但由于其固有的细胞溶解活性，无法直接使用天然的溶血素蛋白作为候选抗原，这成为该研究领域长期存在的关键问题。适当解毒并保持免疫原性的溶血素是理想的疫苗候选抗原。鉴于此，开发肺炎球菌溶血素疫苗所面临的首要问题是必须解决溶血素的细胞膜裂解毒性。

2 溶血素的解毒

为了解决溶血素对细胞膜打孔的毒性问题，研究者采取了各种各样的减毒措施，在不同程度上降低了溶血素的毒性，推动了基于溶血素为抗原的新型肺炎球菌疫苗的开发。

2.1 溶血素的生物学解毒方法 为了降低溶血素的细胞裂解活性，研究者对其关键基因序列进行了各种基因工程修饰，见表1。早在1991年，澳大利亚的PATON研究组报道了一个广泛研究的溶血素突变体，通常称为PdB类毒素，在433位有色氨酸-苯丙氨酸取代（Trp433Phe）［22］。虽然 PdB 突变体是一个有希望的疫苗候选抗原，但其具有低水平的溶血活性。该突变体在宿主细胞膜中形成大孔，与野生型溶血素相比，其溶血活性保留了0.1%～1%。后来，该研究组又报道了几种溶血素突变体：His367Arg、Trp433Phe Cys428Gly、Trp433Phe Cys428Gly Asp385-Asn，其细胞毒性分别为野生型溶血素的0.02%、0.000 1%和 0.000 1%［23］。

表1 溶血素的基因突变体Tab.1 Mutants of pneumolysin

英国格拉斯哥大学的KIRKHAM等［24］通过在具有寡聚功能的区域进行突变，构建了一系列溶血素突变体，从中筛选出两种解毒溶血素突变体：一个是单一氨基酸缺失的溶血素突变体△A146 Ply，该突变体不能在细胞膜中打孔或刺激可由天然溶血素处理引起的体内炎症效应，非常适合作为蛋白抗原；另一个是△6Ply，在参与寡聚的区域有一个双氨基酸缺失（A146R147），与其他溶血素突变体不同，其显示出良好的免疫原性而无打孔活性，且在体外不会诱导与人中性粒细胞的组织损伤相关的促炎活性［25］。

赛诺菲巴斯德制药公司报道了一个高度解毒的溶血素突变体PlyD1［26］，其显著优点是具有双重解毒机制。为构建PlyD1而设计的两个关键突变是T65C和G293C，仅突变G293C可消除溶血素的溶血活性。此外，T65C和G293C的联合突变，可在溶血素的1域与3域之间引入一个二硫键，以防止溶血素从前孔向成孔构象转变。从疫苗安全性角度来看，这种内在的解毒机制双保险非常可取。该公司还报道了一种系统的结构驱动法（systematic structuredriven approach），使用3种构象限制技术，合理地设计了缺乏溶血活性但仍能诱导针对野生型毒素的中和抗体的溶血素衍生物［27］。

吉林大学的SUN等［28］通过替换两种氨基酸（C428G和W433F）开发了一种高度脱毒的溶血素突变体PlyM2，其失去了细胞毒性，但保留了诱导中和抗体的能力。

2.2 溶血素的其他解毒方法 溶血素解毒除了主要采用上述基因工程方法之外，还有一些化学和物理方法。瑞典的葛兰素史克疫苗公司报道采用优化的甲醛处理方法制备了一个完全解毒且解毒不可逆的溶血素，并有望大规模生产［29］。用该解毒溶血素处理实验鼠，并通过注射部位的组织学分析证实了解毒效果。用该解毒溶血素免疫接种，诱导了溶血素特异性功能抗体，能够在溶血实验中抑制溶血素活性。此外，用该解毒溶血素免疫小鼠，可抵抗溶血素的致命鼻内攻击，且鼻腔免疫接种可抑制同源或异源性肺炎球菌菌株的鼻咽定植［29］。上述研究表明，该解毒溶血素作为一种有效的候选抗原可用于进一步开发肺炎球菌疫苗。

在前期研究中我们尝试采用纳米技术来解决溶血素的毒性问题。对溶血素采用简单的热处理（70℃）和Fe3+复合的简易物理方法，制备减毒溶血素纳米颗粒疫苗制剂。该方法能有效降低溶血素的毒性，但在免疫接种实验中未能诱导有效的抗体。推测其原因在于：热处理会改变溶血素抗原的构象，从而破坏一些抗原决定簇的空间结构。

3 溶血素的佐剂／递送系统

作为亚单位疫苗，纯化的可溶性溶血素本身免疫原性较差，还需为其匹配合适的疫苗佐剂，用于辅助该抗原，诱导安全、有效的保护性免疫应答［30］。随着对疫苗佐剂研究的不断深入，依据其作用机理，可将疫苗佐剂分为免疫刺激分子和抗原递送系统。前者主要通过直接刺激免疫系统而辅助抗原引发更高强度的免疫应答，后者主要通过有效的携带和递送抗原而促进抗原的免疫应答。

3.1 与溶血素配伍的传统佐剂 在新型肺炎球菌溶血素疫苗的开发过程中，针对解毒的溶血素抗原，主要是直接使用传统的佐剂与之配伍，制备成疫苗制剂，如解毒的溶血素突变体 PdB［31］、ΔA146 Ply［24］、PlyD1［32］等均使用了铝佐剂［33］。也有报道以单磷酸脂（monophospholipid，MPL）A 为佐剂，用于溶血素类毒素衍生物（a genetic toxoid derivative of pneumolysin，W433F，PdB）的免疫接种攻毒实验［31］。

赛诺菲巴斯德制药公司研究了由肺炎球菌组氨酸三联体蛋白D（pneumococcal histidine triad protein D，PhtD）、肺炎球菌胆碱结合蛋白A（pneumococcal choline binding protein A，PcpA）和解毒溶血素突变体PlyD1 3种抗原组成的实验性肺炎球菌疫苗的免疫原性、稳定性和吸附特性，结果表明，采用氢氧化铝佐剂的每个抗原的抗体反应均显著高于用磷酸铝佐剂或无佐剂的抗原。较低的微环境pH值和较低的抗原吸附强度显著提高了抗原的稳定性。抗原的稳定性与其在小鼠体内的免疫原性密切相关，表明用磷酸根离子预处理氢氧化铝佐剂可提高其稳定性。该研究发现，铝盐佐剂的类型（氢氧化铝和磷酸铝佐剂）、吸附强度和微环境pH值对该疫苗的免疫原性和化学稳定性有显著影响［34］。

3.2 溶血素的新型递送系统 与免疫刺激分子的佐剂原理不同，抗原载体／递送系统能在抗原的负载、缓控释、靶向抗原递呈细胞、抗原摄入、抗原递呈方式等各方面促进对抗原的有效递送，在诱导体液和细胞免疫应答方面具有独特优势。吉林大学的LU等［35］首先开发了一种高度脱毒的溶血素突变体Plym2，再以细菌样颗粒（bacteria like particles，BLPs）为载体和免疫增强剂，将Plym2蛋白展示在该颗粒表面，研制成Plym2鼻黏膜接种疫苗。巴西的GOULART等［36］采用重组卡介苗（BCG）菌株（一种已知佐剂特性的结核病预防性疫苗）来表达并递送PspA-PdT融合蛋白，制成新型肺炎球菌疫苗。

古巴的 GONZÁLEZ-MIRó 等［37］在聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate，PHB）珠上分别展示肺炎球菌血清型19F的溶血素和荚膜多糖，以增强免疫原性，评价了PHB珠作为蛋白抗原溶血素和荚膜多糖载体的潜力，检测了疫苗接种后的体液和细胞免疫应答，用于预防肺炎球菌感染。为了在PHB珠表面展示溶血素，将溶血素与PHB合酶（PhaC）的N-端融合，该酶介导重组大肠埃希菌中PHB珠的组装，展示溶血素的PHB珠作为抗原递送系统。该研究组还采用化学方法将荚膜多糖19F偶联至分离的PHB珠上，以进一步评估其抗原载体特性。

重庆医科大学的WU等［38］将几种主要的磷酸钙生物矿化肽融合至溶血素解毒突变体ΔA146PLY的C-端，从而使生物相容性的磷酸钙可与该蛋白一起矿化，以制备生物矿化的溶血素纳米颗粒。他们制备了4种不同的纳米粒子，并阐明了磷酸钙结合域对纳米粒子大小、形状及表面钙含量的影响，并研究了其免疫保护作用，以筛选出体外和体内最有效的制剂。

4 展望

以溶血素为抗原的新型肺炎球菌疫苗的开发，需从溶血素的解毒及其佐剂／递送系统的选择两方面开展。在溶血素的解毒方面，除了现有的基因工程方法之外，还需进一步尝试一些简单、易行、有效的物理或化学方法，以便大规模生产；在溶血素的佐剂／递送系统的选择方面，仍需进一步尝试更多的新型佐剂或抗原递送系统，以辅助溶血素引发高效安全的免疫应答保护。