固定化醋酸菌发酵载体对芒果醋品质影响

胡秦佳宝，王建芳，熊文霸，杜林，马博

(百色学院 农业与食品工程学院，广西 百色 533000)

芒果(MangiferaindicaL.)属于呼吸跃变型果实，易腐且对低温敏感，不易贮存。因此，开展芒果深层次加工，是芒果产业适应市场需求、提高经济效益的重要任务。芒果风味独特，营养丰富，富含大量果糖、蔗糖、葡萄糖、多酚、有机酸等物质[1]，非常适宜作为果醋酿造原料。果醋一般是以水果及水果下脚料为原料，以酵母菌、醋酸菌为菌种发酵得到的一种营养丰富、风味优良的酸性调味品及功能性饮料[2]。果醋中含有大量芳香酯类、维生素及氨基酸成分，不仅风味柔和怡人且具有调节肠道菌群、抗氧化、保护心脑血管等多种功效[3]。果醋的酿造工艺目前多采用游离细胞液态深层发酵法，发酵时间长达4～5周，且原料中多酚等物质在氧气作用下会转化成醌类物质，导致醋酸发酵过程中果醋色泽劣变，丧失原果风味，品质显著降低。

固定化细胞技术是将微生物细胞高度密集地固定在所选载体上，使微生物能够在适宜的条件下大量快速增殖并保持代谢和催化活性的生物技术[4]。固定化模拟了微生物在自然环境中生长时发生的封闭效应和聚集效应，有利于细胞的分隔[5]。将固定化技术应用于芒果醋发酵，提高了发酵效率，提升了产品品质，对于提升芒果产业附加值有重要的意义。

本试验采用吸附固定化技术，选用甘蔗渣、玉米芯、刨花、花生壳及聚氨酯作为吸附固定化材料，并与海藻酸钠包埋固定化进行对比，从理化和感官两方面研究不同载体固定化作用下对芒果醋品质的影响。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

芒果(台农一号)：市售；甘蔗渣、玉米芯、刨花、花生壳：市售并自行加工；L-抗坏血酸(食品级)、柠檬酸(食品级)：河南万邦实业有限公司；酵母：安琪葡萄酒果酒专用酵母，安琪酵母股份有限公司；醋酸菌(巴氏醋杆菌巴氏亚种Acetobacterpasteurianussubsp.pasteurianus)：中国轻工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 仪器与设备

HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；LRH-250A生化培养箱 韶关市泰宏医疗器械有限公司；LB50T糖度计 广州铭睿电子科技有限公司；25×16型血球计数板 上海荣鹏信息科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

选用成熟度高、无病虫害、无机械损伤的小台农芒果。将芒果清洗后沥干并去皮、去核，切小块放入打浆机中破碎，在破碎时加入总体积0.1%的L-抗坏血酸。芒果浆平均总可溶性固形物(total soluble solid，TSS)含量为4.4%，pH为4.1，加入果浆总体积0.03%的果胶酶，蔗糖溶液将总可溶性固形物含量调至16%，柠檬酸调节果浆酸度至pH 3.8，75 ℃杀菌10 min[6]。

1.3.2 酒精发酵

称取待发酵液总体积0.03%的安琪酵母菌加入5%白砂糖溶液中，37 ℃恒温水浴活化30 min。用血球计数板计数并调整接种量为106CFU/mL。取3 L芒果浆于玻璃发酵罐中，接入10 mL活化酵母菌液于25 ℃恒温培养箱中用纱布封口发酵培养，期间适当搅拌，至发酵液有酒精味产生，以带单向阀的硅胶塞取代纱布继续发酵；每24 h取样测定酒精度和可溶性固形物含量。当酒精度或TSS基本保持稳定时，视作发酵完成；用120目筛过滤发酵液[7]。调整初始酒精度为7.5%(V/V)。

1.3.3 醋酸菌活化及制备菌悬液

将冻干醋酸菌粉连续3代活化培养后接入醋酸菌液体培养基中，以130～150 r/min的转速，在30 ℃培养72 h后取20 mL菌液，以5000 r/min离心15 min，取沉淀并冲洗，于湿菌体中加入无菌生理盐水，配制为含一定醋酸菌浓度的醋酸菌悬浮液并备用。

1.3.4 醋酸发酵

1.3.4.1 包埋固定化醋酸发酵

将醋酸菌悬液加入4%(W/V)的海藻酸钠溶液，充分混匀。将其滴入4% CaCl2溶液中，20 ℃水浴1 h。倾去上清液，冲洗菌悬液并再次加入CaCl2溶液，于4 ℃静置平衡12 h[8]。取30 mL醋酸菌悬液移入芒果酒中，于30 ℃，220 r/min摇床培养，发酵7 d(168 h)，每24 h完成一个批次的发酵，取出部分醋酸发酵液，重新加入芒果酒进行第二批次的醋酸发酵，共进行5个批次。

1.3.4.2 吸附固定化

甘蔗渣：将甘蔗剥皮，切小块，通过压榨水煮后，用70%的酒精浸泡(固液比1∶3，W/V)8 h，烘干并磨成颗粒状。高压灭菌并冷却后装PE袋待用[9]。

玉米芯、刨花、花生壳：洗净、烘干并磨成颗粒状。高压灭菌并冷却后装PE袋待用[10]。

取载体材料(甘蔗渣、玉米芯、刨花、花生壳、聚氨酯)5 g，装入100 mL去底座、底部打孔的塑料量筒的约1/3处，量筒下部裹纱布卡在500 mL锥形瓶瓶口作为发酵装置，用灭菌水浸湿载体至其最大持水量，直到水开始从载体材料中渗出，以除去载体颜色。取30 mL醋酸菌悬液加入载体，在4 ℃下吸附培养12 h。将芒果酒匀速滴入到载体材料中，用6层纱布封口，温度保持在(28±2) ℃。每24 h完成一个批次的发酵，取出部分醋酸发酵液，重新加入芒果酒进行第二批次的醋酸发酵，共进行5个批次。以游离分批发酵作为对照组。

1.3.5 理化指标测定方法

1.3.5.1 酒精度

参考GB/T 394.2-2008《酒精通用分析方法》。

1.3.5.2 总酸含量

参考GB/T 5009.41-2003《食醋卫生标准的分析方法》。

1.3.5.3 醋酸转化率[11]

1.3.5.4 总酚含量

采用福林-酚法[12]。取0.5 mL样品，加入1 mL质量比为10%的福林-酚显色剂，放置6 min，加入2 mL质量比为7.5%的Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至 10 mL，于75 ℃避光放置10 min，并于765 nm波长下测定其吸光度。样品总酚含量以每100 mL样品中没食子酸的当量(mg GAE/100 mL) 表示。

1.3.5.5 抗氧化能力

采用DPPH法[13]。

1.3.5.6 有机酸含量

采用HPLC法[14]。

1.3.5.7 感官评价

由10名感官评分员组成的感官评定小组对果醋按照表1的评分标准进行评价。

表1 固定化醋酸菌芒果番茄复合果醋感官评价表Table 1 The sensory evaluation of mango and tomato compound fruit vinegar with immobilized Acetobacter

2 结果与分析

2.1 不同载体固定化发酵芒果醋总酸含量及醋酸转化率变化结果

海藻酸钠包埋醋酸菌和甘蔗渣、玉米芯、刨花、花生壳及聚氨酯作为吸附醋酸菌载体进行固定化醋酸发酵，并与普通游离醋酸发酵相对照。发酵周期为168 h，每24 h取样检测发酵液的总酸含量变化并计算醋酸转化率，见图1。

图1 不同载体固定化发酵芒果醋总酸含量变化Fig.1 The changes in total acid content of mango vinegar by immobilized fermentation with different carriers

由图1可知，发酵液总酸含量随着发酵时间的增加而增加。前24 h产酸速率较慢，可能原因是发酵早期，醋酸菌需要一段时间适应并产生所需的挥发性酸度[15]。24～120 h以内产酸速率较快，发酵周期的后48 h产酸速率降低，主要原因可能是醋酸发酵后期发酵液的酸度累计到较高浓度，醋酸菌加速衰老，发酵产酸受到抑制。由于醋酸菌在缺乏营养物质时会分解部分醋酸[16]，可观察到发酵周期后24 h，玉米芯吸附和海藻酸钠包埋固定化发酵液酸度略有下降。由图1可知，不同的吸附及包埋固定化材料产酸速率差异显著，前120 h产酸速率为：甘蔗渣>聚氨酯>刨花>海藻酸钠>玉米芯>对照。发酵液中的最高总酸含量依次为：聚氨酯(4.9 g/dL)>甘蔗渣(4.83 g/dL)>刨花(4.56 g/dL)>玉米芯(4.51 g/dL)>海藻酸钠(4.27 g/dL)>对照(3.35 g/dL)。发酵结束时，发酵液中总酸含量依次为：聚氨酯>甘蔗渣>刨花>玉米芯>海藻酸钠>对照。综上，吸附法固定醋酸菌发酵与包埋固定化和游离发酵相比，产酸速度更快，产酸量更大。以聚氨酯作为吸附固定化材料，与天然吸附固定化材料相比，发酵产酸量更大。研究表明，吸附固定化减少了O2扩散及生产扩大后封装基体的缺陷。聚氨酯多孔率超过97%，孔径较大，载体表面完全暴露于发酵液体中，增加了与醋酸菌体的接触面积，吸附均匀，发酵效率高。而甘蔗渣作为制糖副产物，由半纤维素和木质素构成，内腔式多孔特性，醋酸菌附于多孔结构内部，利于溶氧和营养物质的传递。因此，从产酸效果和经济因素考虑，聚氨酯和甘蔗渣是芒果醋固定化发酵较合适的载体。

图2 不同载体固定化发酵芒果醋醋酸转化率变化Fig.2 The changes in acetic acid conversion rate of of mango vinegar by immobilized fermentation with different carriers

由图2可知，醋酸发酵前期，醋酸转化率较低，处于对数期的醋酸菌数量有限，转化乙醇能力较低；醋酸发酵第24～120 h，醋酸转化率逐渐增加，第144 h之后发酵液中溶解氧含量使得大多数醋酸菌处于生长期，耗去发酵液中大量养分，同时发酵过程发酵液中酒精不断蒸发，酒精度降低，因此醋酸转化率下降。而不同固定化载体对醋酸转化率影响较大。由图2可知，聚氨酯和甘蔗渣作为载体的芒果醋醋酸转化率在醋酸发酵第168 h分别达到92%和90%，高于对照组和其他固定化载体发酵芒果醋。

2.2 不同载体固定化发酵芒果醋有机酸含量变化结果

芒果中参与风味变化的有机酸主要包括乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、草酸、琥珀酸及酒石酸。在一个发酵周期结束时，测定不同载体固定化醋酸发酵液的主要呈味有机酸浓度，由表2可知，从芒果汁到芒果醋的酿造过程中，有机酸的含量发生了显著变化。芒果特征性有机酸——草酸在芒果汁至芒果酒的发酵过程中减少，而在醋酸发酵过程中又增加。乳酸作为酒精发酵的产物[17]，在酒精发酵过程中含量显著增加。但由于醋酸菌的代谢作用和发酵液的沉淀作用，使苹果酸、柠檬酸、酒石酸的含量在芒果汁至芒果酒至芒果醋发酵过程中均呈总体下降趋势。琥珀酸在酒精发酵过程中产生，在醋酸发酵过程中含量逐渐增加。琥珀酸与乳酸共同作用除使得果醋具有鲜爽的酸味和香气外，还使得产品具有独特的质地并有助于抑制腐败微生物的生长。以甘蔗渣和聚氨酯作为固定化材料的芒果醋乳酸和琥珀酸含量相对较高。

表2 不同载体固定化发酵芒果醋有机酸含量变化 Table 2 The changes in organic acid content of mango vinegar by immobilized fermentation with different carriers

2.3 不同载体固定化发酵芒果醋感官评价变化结果

由表3可知，以不同材料作为醋酸菌固定化的载体进行醋酸发酵到达醋酸发酵终点时，所得的芒果醋风味和状态有所不同，其中以甘蔗渣作为载体的芒果醋感官评价总得分最高，以刨花为载体的芒果醋感官评价总得分最低，且以甘蔗渣为载体材料所得的复合果醋与游离醋酸菌所得的复合果醋在色泽、气味、滋味、形态上最为相似。

表3 不同固定化载体发酵芒果醋感官评价结果Table 3 The changes in sensory evaluation results of mango vinegar by immobilized fermentation with different carriers

海藻酸钠包埋固定化法发酵芒果醋酸味较协调，因包埋法对细胞的固定效果好，细胞不易脱落[18]，故果醋澄清度好，基本无沉淀物，但果醋香气不浓。以刨花、花生壳为载体材料固定化发酵所得的复合果醋均有苦涩味和材料本身的异味，而甘蔗渣和玉米芯本身具有果香和残余糖分，作为载体材料发酵芒果醋酸味协调，气味清香。但由于吸附法对细胞的吸附力较弱，因而细胞容易脱落，因此都有少量沉淀物。再结合甘蔗渣和玉米芯的感官评分，甘蔗渣感官评分78.53分>玉米芯感官评分75.58分，故甘蔗渣作为载体材料固定化发酵所得的复合果醋更符合大众口味。

2.4 不同载体固定化发酵芒果醋总酚及抗氧化能力变化结果

不同固定化材料进行一个周期醋酸发酵所得芒果醋中总酚含量及抗氧化能力见图3。

图3 不同固定化载体发酵芒果醋总酚及抗氧化能力变化Fig.3 The changes in total phenols and antioxidant capacity of mango vinegar by immobilized fermentation with different carriers

由图3可知，采用醋酸菌固定化发酵方式可显著保留芒果醋中的酚类物质及抗氧化能力。在发酵过程中，酚类物质含量受到温度、O2及发酵液中其他物质成分的影响。醋酸发酵前期，有机酸含量较低，部分酚类物质在多酚氧化酶及O2的作用下生成醌类物质，造成酚类物质的损失及加深发酵液的色度[19]。包埋法固定化的微生物细胞的生理状态受到多孔介质造成的扩散限制作用以及高密度的生物量影响，其平均摄氧量小于游离细胞[20]，故海藻酸钠包埋法制得芒果醋总酚含量为(1.64±0.08) mg GAE/mL，对DPPH自由基的清除能力相当于(8.67±0.34) μmol Trolox/L，高于游离(对照)醋酸菌发酵及吸附固定化醋酸菌发酵制得的芒果醋。

DPPH自由基清除法是评价酚类物质抗氧化活性的体外实验法，本试验中DPPH自由基清除能力试验结果与总酚含量趋势基本一致：海藻酸钠(8.67±0.34)μmol Trolox/L>聚氨酯(8.1±0.34)μmol Trolox/L>甘蔗渣(7.93±0.21) μmol Trolox/L>玉米芯(7.78±0.30) μmol Trolox/L>刨花(6.8±0.25) μmol Trolox/L>花生壳(6.67±0.31) μmol Trolox/L>游离(对照)(4.33±0.26) μmol Trolox/L。经分析，刨花、玉米芯及甘蔗渣的总酚含量无显著性差异。聚氨酯材料孔隙度超过97%，载体表面完全暴露，醋酸菌在其上的粘附分布高度均匀，较好地减缓了酚类物质的氧化过程。

2.5 分批次连续发酵不同载体固定化总酸含量变化结果

为比较不同载体固定化醋酸发酵稳定性，在5个发酵周期的发酵终点取发酵液测定总酸含量，由图4可知，不同固定化载体5个批次发酵液酸度上升规律基本一致，均在第3个周期结束时产酸量达到最大值。可能是由于被固定化的醋酸菌在第3批发酵中菌数达到最大值，后两个批次发酵时固定化细胞的死亡率持续增加使得产酸量下降。

图4 分批次连续发酵不同固定化载体发酵芒果醋总酸含量变化Fig.4 The changes in total acid content of mango vinegar by batch continuous immobilized fermentation with different carriers

游离醋酸发酵在第2个批次达到最大产酸值，聚氨酯、刨花和花生壳作为载体材料，每个批次发酵各自差异较小，稳定性较好；以甘蔗渣、玉米芯及海藻酸钠作为载体材料，在后两个批次发酵产酸量下降较多，醋酸发酵试验后期，甘蔗渣和玉米芯质地变软粘稠，无法保持醋酸菌固定化结构。同时，菌体在载体材料缝隙内产生菌膜，从而增加氧气消耗，醋酸菌逐渐失活，产酸能力迅速下降。海藻酸钠包埋的醋酸菌摄氧率小于吸附固定化细胞[21]，在后面批次的发酵中醋酸菌的死亡率较高，使得产酸率下降。

3 结论

与包埋法和游离醋酸发酵相比，吸附法固定醋酸菌醋酸发酵产酸速度更快，产酸量更大。以聚氨酯作为吸附固定化材料，与天然吸附固定化材料相比，发酵产酸量更大。从产酸效果和经济因素考虑，聚氨酯和甘蔗渣是芒果醋固定化发酵较合适的载体。聚氨酯和甘蔗渣作为载体的芒果醋醋酸转化率在醋酸发酵第7天分别达到92%和90%，高于对照组和其他固定化载体发酵的芒果醋。以甘蔗渣和聚氨酯作为固定化材料的芒果醋乳酸和琥珀酸含量相对较高。以甘蔗渣作为载体的芒果醋感官评价总得分最高，以刨花为载体的芒果醋感官评价总得分最低。海藻酸钠包埋法制得芒果醋总酚含量为(1.64±0.08) mg GAE/mL，对DPPH自由基的清除能力相当于(8.67±0.34) μmol Trolox/L，高于游离(对照)醋酸菌发酵及吸附固定化醋酸菌发酵制得的芒果醋。刨花、玉米芯及甘蔗渣的总酚含量无显著性差异。不同固定化载体5个批次发酵液酸度上升规律基本一致，均在第3个周期结束时产酸量达到最大值。聚氨酯、刨花和花生壳作为载体材料，每个批次发酵各自差异较小，稳定性较好；海藻酸钠包埋的醋酸菌摄氧率小于吸附固定化细胞，在后面批次的发酵中醋酸菌的死亡率较高，使得产酸率下降。本研究结果可为芒果醋酿造工艺提供理论参考依据，促进芒果产业附加值的提升。