甜面酱中挥发性风味物质及游离氨基酸分析

左勇，陈静，张晶

(1.四川师范大学 生命科学学院，成都 610101；2.宜宾学院质量管理与检验检测学部，四川 宜宾 644000；3.重庆大学 生物工程学院，重庆 400044)

甜面酱又称甜酱、面酱，是以小麦或面粉为主要原料，经蒸煮、接种制曲、拌盐水发酵后酿制而成的半固态调味品[1]，其口感独特、色泽鲜美，常作酱腌菜等辅料之用。在甜面酱成熟过程中，淀粉质类物质被降解为还原糖赋予酱醪甜味；蛋白质在蛋白酶水解作用下被分解为小分子肽、氨基酸等赋予甜面酱鲜味；微生物代谢所产生的大量有机酸与醇类等物质通过酯化作用产酯赋予甜面酱柔和的酯香；发酵过程中的美拉德反应赋予甜面酱鲜亮的色泽[2]。

近年来，甜面酱中挥发性风味成分的相关研究屡有报道，孟鸳等[3]对比不同的萃取方式分析甜面酱中的挥发性成分，发现顶空固相微萃取法对挥发性的酯类和烯烃类化合物的提取效果最佳；张静等[4-7]对影响顶空固相微萃取提取甜面酱中挥发性成分的因素进行相关研究；左勇等[8]对甜面酱保温发酵过程中的挥发性成分的动态变化进行研究，结合主成分分析，综合评定保温发酵7周的甜面酱风味最佳；黄明泉等[9-12]发现甜面酱中氨基酸含量最高的是谷氨酸，呈现鲜味。

本研究采用主成分分析法，对保温发酵不同时间后经晒露成熟的甜面酱中的挥发性风味成分进行综合评价，确定风味最佳的样品，再对甜面酱中游离氨基酸的呈味贡献进行分析，以确定呈味最佳的样品。根据香味与呈味研究结果，推断最佳保温发酵时间，以期为两段式发酵技术(先保温发酵后晒露)提供风味品质评价依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜面酱：分别保温发酵20，25，30，35，40 d后，再经晒露成熟的甜面酱样品，分别编号为1～5。

萃取头：50/30 μm DVB/CAR/PDMS；手动进样器；顶空萃取装置 美国Supelco公司；6890N-5979B气相色谱-质谱联用仪 美国Agilent公司；ThermoFisher U3000液相色谱仪 上海力晶科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 挥发性风味成分测定

采用顶空固相微萃取技术提取甜面酱香气成分，再利用气相色谱-质谱联用仪分析挥发性成分组成及含量。

1.2.1.1 样品处理

称取4 g甜面酱样品和1 g氯化钠于盛有6 mL蒸馏水的15 mL顶空瓶中，60 ℃水浴平衡5 min，待萃取头吸附60 min后将其移至气相色谱的高温汽化室中解吸5 min进行GC-MS分析。萃取头老化：萃取头在GC进样口于270 ℃老化5～10 min，插入装有平衡5 min的样品顶空瓶中，于60 ℃水浴保温60 min后进行GC-MS分析。

1.2.1.2 GC-MS条件

色谱条件[13]：柱型采用Agilent DB-Wax毛细管色谱柱(60 m×250 μm×0.25 μm)；手动不分流进样，进样口温度为250 ℃；程序升温：初始温度40 ℃，保留3 min，以2 ℃/min的速率升至60 ℃，再以6 ℃/min的速率升至250 ℃，保留5 min；检测器温度250 ℃；载气为He，流速1 mL/min。质谱条件：EI离子源，电子能量70 eV，扫描范围10～450 amu，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃。

1.2.1.3 化合物定性方法[14]

由GC-MS得到谱图, 参照标准谱库(NIST 05)确定挥发性风味成分。仅当匹配度纯度>800的鉴定结果才予以报道。

1.2.1.4 化合物定量方法

采用峰面积归一化法对甜面酱中的各挥发性组分进行定量分析，求得各组分的相对含量。

1.2.2 游离氨基酸分析

采用高效液相色谱法测定保温发酵后并经晒露成熟的甜面酱样品的游离氨基酸含量。

1.2.2.1 样品处理

准确称取1 g样品于50 mL的容量瓶中，加0.01 mol/L的盐酸40 mL，旋涡混匀5 min，超声提取5 min，定容。避光静置2 h，取5 mL 4000 r/min离心10 min，准确取1 mL上清液，加入1 mL 2%～4%磺基水杨酸，涡旋1 min，避光静置1 h，15000 r/min离心15 min，精密量取上清液500 μL于5 mL塑料离心管中，精密加入1 mol/L三乙胺乙腈溶液250 μL，混匀，精密加入0.1 mol/L异硫氰酸苯酯-乙腈溶液250 μL，混匀，室温放置1 h，加2 mL正己烷，剧烈振摇，放置10 min，取下层溶液用0.22 μm的水相膜滤过滤上机分析。

1.2.2.2 色谱条件

色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温：40 ℃；波长：254 nm；流动相A：0.1 mol/L醋酸钠溶液(取无水醋酸钠8.2 g，加水900 mL溶解，用冰醋酸调pH至6.5，然后加水至1000 mL-乙腈(93∶7)。流动相B：乙腈-水(8∶2)；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

1.3 数据处理

挥发性风味物质主成分分析采用SPSS 19.0软件[15]，采用Origin作图。

2 结果与分析

2.1 甜面酱挥发性风味物质总离子流图

保温发酵后经晒露成熟的甜面酱样品中挥发性风味物质的离子流图谱见图1。

图1 甜面酱的挥发性成分的GC-MS总离子流色谱图Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in sweet soybean paste注：图中1～5分别代表1～5号样品。

离子流图能够反映挥发性风味物质的组成和丰度，见图1。保温发酵不同时间后经晒露相同时间后成熟的甜面酱中挥发性风味物质的组成差异不大。

2.2 甜面酱挥发性风味物质测定结果

采用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用技术，从甜面酱中共检测出33种挥发性风味物质，其中醇类3种，酯类14种，醛类9种，酚类1种，烷烃类3种，其他化合物3种。通过面积归一化法求得各类化合物的相对百分含量，结果见表1。

表1 先保温后晒露成熟的甜面酱中主要挥发性物质的相对含量Table 1 The relative content of main volatile components in sweet soybean paste produced by two-stage fermentation

由表1可知，甜面酱中挥发性成分的组成及含量受保温发酵时间的影响。为选择具有代表性的成分作为反映先保温后晒露发酵法生产的甜面酱整体风味的指标，故对保温发酵后经晒露成熟的甜面酱的风味物质组成及相对含量进行主成分分析，通过降维处理问题的思路，提取少数几个综合指标实现对风味的综合评价。

计算各主成分的贡献率与累积贡献率，累积贡献率不低于85%时，表明所选主成分能够包含全部指标的绝大部分信息。各成分的特征值以及贡献率见表2。

表2 主成分的特征值以及贡献率Table 2 The eigenvalues and contribution rates of principal components

由表2可知，前3个特征值的累积贡献率为90.77%，说明前3个主成分基本包含了全部指标所具有的信息。故选取前3个特征值，即将原来指标转化为4个新的指标，起到了降维的作用，能够比较客观地反映两阶段晒露法所生产的甜面酱风味物质的组成情况。第1主成分可解释挥发性风味物质组成总变异的43.66%，第2主成分能够解释34.08%，第3主成分可解释13.04%。前3个特征值对应的特征向量见表3。

表3 主成分特征向量表Table 3 The eigenvector values of principal components

续 表

由表3可知，棕榈酸乙酯、苯乙酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十五酸乙酯、亚麻酸乙酯、乙酸苯乙酯、棕榈酸异丁酯、十四烷与第1主成分呈正相关；异戊醇、糠醛、5-甲基呋喃醛、苯乙醛、2-苯基巴豆醛、2-乙酰基吡咯与第2主成分呈高度正相关；苯乙醇、苯甲醛、苯乙醛、2,4-二叔丁基苯酚与第3主成分呈正相关。故可将棕榈酸乙酯、苯乙酸乙酯、9-十六碳烯酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、十五酸乙酯、亚麻酸乙酯、乙酸苯乙酯、棕榈酸异丁酯、异戊醇、苯乙醇、糠醛、5-甲基呋喃醛、苯甲醛、苯乙醛、2-苯基巴豆醛、2,4-二叔丁基苯酚、十四烷、2-乙酰基吡咯视为两阶段发酵法所生产的甜面酱中主要的挥发性风味物质。

通过对各特征向量数据中心化和标准化后求得各主成分的得分，以每个主成分的方差贡献率作为权重，计算出样品质量的综合评价指数。综合评价指数越大，综合质量越好[16]。通过SPSS计算出的挥发性风味物质的综合评价得分见表4。

表4 标准化后主成分得分Table 4 The scores of principal components after standardization

由表4可知，4号样品综合得分最高，即保温发酵35 d再经晒露成熟的甜面酱中挥发性风味物质综合评价最好。结合表1可知，4号样品中测得的挥发性风味物质有23种，其中酯类有11种、醇类2种、醛类7种、酚类1种、烷烃类1种、其他1种；其挥发性风味物质的组成与含量均较高，与综合评分结果一致。挥发性风味物质的种类和含量在一定程度上影响甜面酱的风味品质，甜面酱感官评价中香气主要来源自挥发性风味物质。综合而言，4号样品的风味最佳。

2.3 甜面酱中游离氨基酸组成分析

保温发酵不同时间后经晒露成熟的甜面酱样品中游离氨基酸含量的测定结果见表5。

表5 甜面酱游离氨基酸定量结果Table 5 The quantitative results of free amino acids in sweet soybean paste

由表5可知，保温发酵不同时间后经晒露成熟的甜面酱中，游离氨基酸含量为13.78～16.66 mg/g，4号样品与5号样品在总氨基酸含量上没有显著性差异(P>0.05)。4号样品中游离氨基酸总含量最高，其次为5号样品；游离氨基酸含量最低的为1号样品，部分样品中氨基酸含量存在显著性差异，主要原因在于保温发酵时间不同，使得前期大分子物质转化程度存在差异。先保温发酵再经晒露成熟的甜面酱，酱醪中游离氨基酸含量较高的氨基酸分别为谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸、脯氨酸、亮氨酸，因面粉中蛋白质主要为富含脯氨酸和谷氨酸的麦醇溶蛋白及麦谷蛋白，故这两种游离氨基酸含量均高于其他氨基酸，这与黄明泉等的研究结果大致相同。

2.4 甜面酱中游离氨基酸呈味贡献分析

氨基酸具有不同的风味特征，可以作为食品中的呈味物质。氨基酸呈味贡献可采用味道强度值(taste active value，TAV)来评价，其值为呈味物含量与呈味阈值之比。TAV>1时，表明该物质对观测样品具有呈味贡献，且呈味贡献大小与该值成正比；TAV<1时，表明该物质呈味作用不显著[17]。分别计算保温发酵不同时间后经晒露成熟的甜面酱中游离氨基酸的TAV，结果见表6。

表6 甜面酱中游离氨基酸呈味分析Table 6 The taste active value analysis of free amino acids in sweet soybean paste

由表6可知，各个样品中TAV值大于1的氨基酸有谷氨酸、丙氨酸及缬氨酸，表明这3种氨基酸对甜面酱的呈味具有显著贡献，此外4号样品中天冬氨酸的TAV值也大于1，故该样品中天冬氨酸对呈味也具有贡献。因谷氨酸的TAV值远大于其他氨基酸的TAV值，故其呈鲜味的作用强于其他氨基酸。甜面酱不具有明显苦味，原因可能是呈味物质之间的相互作用掩盖或抑制了苦味的呈现，一些苦味氨基酸低阈值浓度存在时能增强其他氨基酸的呈味作用[19]。因此，甜面酱中游离氨基酸呈味作用主要考察与滋味密切相关且具有呈味贡献作用的鲜味及甜味氨基酸。

TAV值反映氨基酸的呈味贡献。由表5和表6可知，4号样品中鲜味及甜味氨基酸含量均最大，分别约为2.35，3.04 mg/g。两种鲜味氨基酸的TAV值都大于1，对甜面酱的鲜味具有显著贡献；同时，呈甜味的丙氨酸TAV值>1，对甜面酱的甜味有一定的呈味贡献。

就呈味贡献而言，4号样品中呈鲜味、甜味的氨基酸含量是5号样品的1.02倍。故4号样品呈味作用优于5号样品，即保温发酵35 d后经晒露成熟的甜面酱游离氨基酸呈味作用最佳。

3 结论

从不同甜面酱样品中共检测出33种挥发性风味物质。其中风味组成最佳的为保温发酵35 d经晒露成熟的甜面酱，共计23种，其中酯类有11种、醇类2种、醛类7种、酚类1种、烷烃类1种、其他1种。同时，该样品中游离氨基酸的总含量最高约为16.66 mg/g，其中天冬氨酸、谷氨酸及丙氨酸味道强度值大于1，对甜面酱滋味具有显著呈味贡献。