血清miR-223及miR-155对新生儿肺炎的诊断价值研究*

冯 琼，林 虹，蔡兴俊

(海南省人民医院新生儿科，海口 570311)

新生儿肺炎是新生儿常见病，可于宫内、分娩过程中或出生后发病，主要由不同病原体(如细菌、病毒、支原体、真菌等)感染引起，其是引起新生儿死亡的主要原因，有报道围生期新生儿肺炎病死率达10%～20%[1]，对新生儿生存质量、生长发育造成严重影响。因此，早期诊断新生儿肺炎、及时采取相应积极措施进行干预是提高新生儿存活率及生存质量的关键。临床上通常经验性使用广谱抗生素对新生儿肺炎进行治疗，以至于不规范使用抗菌药物导致患儿产生大量耐药菌株，对后续治疗效果带来严重影响[2-3]。新生儿肺炎早期临床表现不明显，病原学检查往往比较滞后，缺乏快速、灵敏、特异的诊断指标[4]。以往研究常以白细胞计数、白细胞介素-6(IL-6)等评价机体炎性反应程度，但此类指标灵敏度、特异度较低[5]。因此，寻求有效、准确的生物学指标对诊断新生儿肺炎意义重大。微小RNA(miRNA/miR)是一类高度保守、内源性、非编码核苷酸，与机体免疫功能异常存在密切关系[6]。邵慧芝等[7]研究发现，与健康儿童比较，重症肺炎患儿外周血miR-223水平明显升高，可作为重症肺炎早期诊断标志物之一。张薇等[8]研究发现，与健康对照组比较，支原体肺炎患儿外周血miR-155表达水平明显升高，推测miR-155参与支原体肺炎的发生、发展。然而，有关miR-223、miR-155在新生儿肺炎中表达情况的研究却鲜有报道，故本研究同时探讨生儿肺炎患儿血清miR-223、miR-155表达情况，以期为诊断新生儿肺炎提供一定参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2015年9月至2017年9月本院新生儿科收治的121例新生儿肺炎患儿作为新生儿肺炎组。纳入标准：(1)符合临床新生儿肺炎诊断标准[9]；(2)足月产；(3)临床资料完整。排除标准：(1)伴有其他感染性疾病；(2)一般情况较差；(3)临床资料不完整。另选取同期于本院正常分娩的120例健康新生儿作为对照组。所有新生儿均为单胎。本研究经本院医学伦理委员会批准，所有标本采集均取得患者及家属知情同意并签字。

1.2 方法

1.2.1主要试剂与仪器

TRIzol试剂(货号MN562J2)、逆转录试剂盒(货号J6547M)、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(货号N5643MJ)购自美国Sigma公司、SYBR Premix ExTaq试剂盒(货号N5643MJ)PrimeScript RT reagent试剂盒(货号ND6527J)、IL-6 ELISA试剂盒(货号726-NDY)均购自北京中衫金桥公司；实时荧光定量PCR分析仪(型号7500)、分光光度计(型号UV-3672)购自美国Sigma公司；全自动荧光免疫分析仪(型号VI-DAS30)购自法国梅里埃公司；全自动酶标仪(型号COBAS 601)购自德国罗氏公司。

1.2.2标本采集及保存

根据所有患儿病原学检测结果及病情，对其进行相应抗菌治疗，分别于治疗前、后抽取静脉血3 mL。对照组采集脐带血3 mL，离心10 min(2 000 r/min)，分离得血清，于-80 ℃冰箱内保存，待测。

1.2.3观察指标

采用全自动荧光免疫分析仪及配套试剂测定受试者治疗前、后血清中降钙素原(PCT)水平，采用全自动酶标仪测定血清中IL-6水平，以上操作严格按照仪器、试剂及试剂盒说明书进行。观察治疗前、后水平变化。

1.2.4qRT-PCR检测血清miR-223、miR-155相对表达水平

采用Trizol试剂提取两组新生儿治疗前、后血清总RNA，按照试剂盒说明书进行操作，使用分光光度计测定RNA浓度和纯度，1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。以RNA为模板，按照PrimeScript RT reagent试剂盒说明书进行逆转录反应，以cDNA为模板，参照SYBR Premix ExTaq试剂盒进行qRT-PCR反应。反应体系20.0 μL：2×UltraSYBR mixture 10.0 μL，cDNA模板(25 ng/μL)2.0 μL，上下游引物各2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。反应条件：预变性95 ℃ 30 s，变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 20 s，共40个循环。引物由大连宝生生物工程有限公司设计并合成，miR-223、miR-155均以U6作为内参基因。采用2-ΔΔCt方法计算两组新生儿血清中miR-223、miR-155相对表达水平。引物设计见表1。

表1 qRT-PCR引物

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 两组一般资料

两组性别、胎龄、年龄、出生方式比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 两组一般资料比较

2.2 两组miR-223、miR-155、PCT、IL-6相对表达水平比较

与对照组比较，新生儿肺炎组治疗前miR-223、miR-155、PCT及IL-6水平明显升高(P<0.05)；两组治疗后miR-223、miR-155、PCT及IL-6水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。与治疗前比较，新生儿肺炎组治疗后miR-223、miR-155、PCT及IL-6水平明显降低(P<0.05)，见表3。

表3 两组miR-223、miR-155、PCT、IL-6相对表达水平比较

2.3 两组miR-223、miR-155及PCT、IL-6相关性分析

Pearson相关性分析显示，两组miR-223与miR-155、PCT、IL-6表达呈正相关(P<0.05)，miR-155与miR-223、PCT、IL-6表达亦呈正相关(P<0.05)，见表4。

表4 两组miR-223、miR-155及PCT、IL-6相关性分析

2.4 miR-223、miR-155、PCT、IL-6对新生儿肺炎诊断的ROC曲线

以血清miR-223、miR-155、PCT、IL-6水平为检验变量绘制ROC曲线，结果显示血清miR-223、miR-155、PCT、IL-6水平诊断新生儿肺炎的AUC分别为0.886(0.833，0.939)、0.825(0.750，0.901)、0.812(0.737，0.891)、0.831(0.839，0.903)，截断值分别11.36、4.32和8.13 ng/mL、35.69 pg/mL，灵敏度分别为85.9%、81.5%、82.7%、83.6%，特异度分别为82.7%、78.7%、77.3%、82.1%；四者联合诊断的AUC为0.956(0.961，0.953)，灵敏度为96.2%，特异度为93.8%，见图1。

图1 miR-223、miR-155、PCT、IL-6对新生儿肺炎诊断的ROC曲线

3 讨 论

新生儿肺炎是新生儿时期常见病、多发病，临床表现往往不典型，常与其他疾病并发，漏诊、误诊率较高，且由于新生儿特殊的生理、免疫状态，使得病情变化较快，极易出现窒息、呼吸衰竭，严重者出现循环衰竭甚至死亡[10]。因此，预防新生儿肺炎的发生，及早做出准确诊断并采取积极措施进行干预是研究的热点。

成熟miRNA是长度为20～23个核苷酸的单链RNA分子，是基因表达的重要调节剂，通常会降低mRNA稳定性。miRNA靶向主要是通过miRNA 5′端(“种子”区域)与mRNA编码区和非翻译区(UTR)内的位点之间的特定碱基配对相互作用实现的。其在调节生物学过程(如免疫细胞谱系的发生、分化和成熟及维持免疫稳态、正常功能)中起着重要作用[11]。但有研究报道，miRNA家族中miR-223[12]、miR-155[13]在肺炎继发脓毒症患者中、支原体感染肺炎模型小鼠中有较高的临床诊断价值。因此推测miR-223、miR-155异常表达与新生儿肺炎发生有关，且有一定的诊断价值。本研究探讨新生儿肺炎患儿血清miR-223、miR-155表达情况，以期为寻找准确、有效的新生儿肺炎早期诊断指标提供一定参考。颜保松等[14]研究发现，肺结核组患者外周血中miR-223水平明显高于健康对照组，且对肺结核具有较高诊断价值。本研究结果显示，新生儿肺炎组患儿治疗前血清中miR-223水平明显高于对照组，治疗后血清miR-223恢复至正常水平，提示miR-223可能与新生儿肺炎发生、发展关系密切。周好好等[15]研究发现，与正常对照组比较，哮喘模型组小鼠肺组织中miR-155水平明显升高，推测miR-155可能参与了哮喘发病过程。本研究显示，新生儿肺炎组患儿治疗前血清中miR-155水平明显高于对照组，治疗后血清中miR-155水平同样恢复至正常水平，提示miR-155可能参与了新生儿肺炎发病过程。

以往有学者以PCT、IL-6等感染性标志物在新生儿肺炎患儿中的表达情况对病情做出诊断[16]。但有研究显示，PCT、IL-6等在新生儿肺炎患儿血清中高表达，与新生儿肺炎发生、发展关系密切，但IL-6灵敏度、特异度较低[17]。本研究结果显示，与对照组比较，新生儿肺炎组患儿治疗前血清中PCT、IL-6水平明显升高，治疗后，血清中PCT、IL-6水平恢复正常水平；与治疗前比较，新生儿肺炎组患儿治疗后血清中PCT、IL-6水平明显降低，与以往研究趋势一致，这提示PCT、IL-6与新生儿肺炎发生、发展关系密切。正常情况下，血液循环中PCT、IL-6水平较低，炎性反应中PCT、IL-6水平升高。研究显示，PCT、IL-6水平与病情严重程度相关，可以反映炎症损伤的严重程度[18]。本研究进一步发现，血清miR-223与miR-155、PCT、IL-6表达呈正相关，miR-155与血清miR-223、PCT、IL-6表达呈正相关。提示血清miR-223、miR-155与PCT、IL-6一样具有早期评估新生儿肺炎的能力。

综上所述，miR-223、miR-155异常高表达可能与新生儿肺炎发生、发展有关，具有评估新生儿肺炎的能力，且miR-223、miR-155、PCT及IL-6联合检测明显提高了对新生儿肺炎的诊断灵敏度及特异度，可为临床对新生儿肺炎的诊断提供一定参考。然而本研究并未对miR-223、miR-155、PCT及IL-6在新生儿肺炎患儿中的具体作用机制进行阐述，因此，后期应进行大样本量的研究并对具体机制进行探讨。