桔梗皂苷D通过抑制AT1-CARP通路改善AMI大鼠心肌细胞凋亡和心脏功能的研究*

孟庆雯，刘华江，黄 珊，杨珊珊，杨 洋

(海南医学院第一附属医院心血管内科，海口 570100)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是世界范围内常见的心血管疾病，亦是导致心源性猝死的主要原因，AMI发病率及病死率高，且总体呈上升趋势[1]，对于治疗AMI新型药物的研究一直是研究的重点。桔梗皂苷D是桔梗的主要化学成分，具有抗炎、降血脂、抗肿瘤等药理作用[2]。已有研究表明，桔梗皂苷D对乳腺癌等有治疗作用[3-4]，但其对AMI的作用尚未有明确研究，本文探讨了桔梗皂苷D对AMI的影响及机制，旨在为AMI的临床治疗提供帮助，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

桔梗皂苷D(上海展舒化学科技有限公司，纯度大于98%)；戊巴比妥(江苏艾康生物医药研发有限公司)；TUNEL细胞凋亡试剂盒(上海碧云天生物技术公司)；ELISA检测试剂盒(天津安诺瑞康生物技术有限公司)；血管紧张素1(AT1)、心锚重复蛋白(CARP)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗、山羊抗体二抗(沈阳万类生物技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒(江苏凯基生物技术有限公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠AMI造模

结扎冠状动脉前降支构建大鼠AMI模型，具体步骤为：腹腔注射50 mg/kg剂量的戊巴比妥溶液麻醉SD大鼠，同时使用面罩通气支持呼吸，于左侧第3或4肋间隙开胸暴露心脏，打开心包，结扎大鼠左冠状动脉前降支，通过心电图ST-T 改变检测心肌梗死。假手术组只穿线不结扎，术毕后逐层缝合关胸。

1.2.2动物给药及分组

假手术组大鼠作为对照，造模成功的AMI大鼠分为AMI组、桔梗皂苷D低、中、高剂量组，其中桔梗皂苷D低、中、高剂量组分别按25、50、100 mg/kg的给药剂量灌胃给药，每天1次，给药4周；假手术组和AMI组给予相同体积和频次的生理盐水。

1.2.3心脏功能检测

各组大鼠给药结束后腹腔注射戊巴比妥麻醉，使用超声显像仪行超声心动图检查，分别检测左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室短轴缩短率(LVFS)和左心室射血分数(LVEF)，比较各组大鼠上述指标。

1.2.4苏木素-伊红(HE)染色

实验结束后解剖获取各组大鼠心肌梗死区域组织，于组织固定液中固定24 h，清洗后经70%、80%、90%、95%的乙醇及无水乙醇梯度水化，再浸入二甲苯溶液中2次，分别于硬石蜡和软石蜡中浸泡30 min，并于石蜡液中冷却凝固。于切片机上制备组织切片，然后将切片置于二甲苯中脱蜡，依次经100%、95%、90%、80%、75%的乙醇水化后，使用苏木素染色5 min，伊红染色2 min，清洗去除染色液后经90%、95%、100%的乙醇浸泡1 min，并将切片置于二甲苯中2次，每次1 min，滴加中性树脂封片后于光学显微镜下观察心肌梗死情况，并拍照记录。

1.2.5TUNEL检测大鼠心肌细胞凋亡

取心肌组织石蜡切片用二甲苯及各梯度乙醇脱蜡至水，然后使用无菌蒸馏水水化5 min后，用0.1 mmol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)进行热修复，分别经过3%H2O2甲醇液、0.1% TritonX-100、20%牛血清、TUNEL 反应混合液、POD转化剂孵育及磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后，DAB 溶液显色，并在显微镜下观察，终止后用迈耶苏木精染核，PBS 冲洗后，甘油封片剂封片，显微镜下观察并拍摄图像。

1.2.6Western blot

给药结束后，取各组大鼠心肌梗死区域组织于液氮保存，然后取大鼠心肌组织50 mg，加入250 μL RIPA蛋白裂解液和2.5 μL的PMSF蛋白酶抑制剂，研磨均匀后4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清液。使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量，加入上样缓冲液后沸水浴使蛋白变性，经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，转膜，用5%的脱脂牛奶对聚偏氟乙烯(PVDF)膜封闭2 h，然后以1∶1 000比例稀释后的AT1、CARP、cleaved-caspase-3、caspase-3、Bax、Bcl-2、GAPDH一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后二抗室温孵育1.5 h，再用TBST洗膜后按照ECL试剂盒说明书配置发光液，并将PVDF膜浸入发光液中反应30 s，曝光并拍照，用Image J软件对曝光结果进行定量分析。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 AMI模型鉴定

心电图检测结果显示，与假手术组比较，AMI组心电图ST段明显抬高，提示AMI大鼠造模成功，见图1。

箭头：SF段抬高。

2.2 桔梗皂苷D对AMI大鼠心脏功能的影响

与假手术组比较，AMI组大鼠LVEDD和LVESD均明显升高，LVFS和LVEF明显降低(P<0.05)。与AMI组比较，桔梗皂苷D低、中、高剂量组LVEDD和LVESD明显降低，LVFS和LVEF明显升高(P<0.05)，且呈剂量依赖性，见表1。

2.3 桔梗皂苷D改善AMI大鼠心肌损伤

假手术组心肌细胞排列整齐，细胞核形态正常，无明显病变；AMI组大鼠心肌细胞排列紊乱，细胞核萎缩，炎性细胞大量浸润，病变明显；桔梗皂苷D低、中、高剂量组大鼠心肌细胞病变得到明显改善，心肌细胞排列较整齐，炎性细胞浸润减少，治疗效果呈剂量依赖性，见图2。

A:假手术组；B:AMI组；C:桔梗皂苷D低剂量组；D:桔梗皂苷D中剂量组；E:桔梗皂苷D高剂量组。

2.4 桔梗皂苷D调控AMI大鼠心肌细胞凋亡

TUNEL结果显示，与假手术组比较，AMI组心肌组织凋亡明显增加(P<0.05)；与AMI组比较，桔梗皂苷D低、中、高剂量组心肌组织凋亡明显减少(P<0.05)，见图3、4。

表1 桔梗皂苷D对AMI大鼠心脏功能的影响

A:假手术组；B:AMI组；C:桔梗皂苷D低剂量组；D:桔梗皂苷D中剂量组；E:桔梗皂苷D高剂量组。

a：P<0.05，与假手术组比较；b：P<0.05，与AMI组比较。

2.5 桔梗皂苷D调控AMI大鼠心肌组织凋亡蛋白表达

Western blot结果显示：与假手术组比较，AMI组心肌组织促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase-3表达水平明显增加，抑凋亡蛋白Bcl-2表达水平明显降低(P<0.05)；与AMI组比较，桔梗皂苷D低、中、高剂量组大鼠心肌组织Bax和cleaved-caspase-3表达水平明显下调，Bcl-2表达水平明显上调(P<0.05)，见图5、6。

A:假手术组；B:AMI组；C:桔梗皂苷D低剂量组；D:桔梗皂苷D中剂量组；E:桔梗皂苷D高剂量组。

a:P<0.05，与假手术组比较；b:P<0.05，与AMI组比较。

2.6 桔梗皂苷D抑制AT1-CARP信号通路

Western blot 结果显示，与假手术组比较，AMI组心肌组织AT1和CARP表达明显增加(P<0.05)。与AMI组比较，桔梗皂苷D低、中、高剂量组AT1和CARP表达水平明显减少(P<0.05)，见图7、8。

A:假手术组；B:AMI组；C:桔梗皂苷D低剂量组；D:桔梗皂苷D中剂量组；E:桔梗皂苷D高剂量组。

a:P<0.05，与假手术组比较；b:P<0.05，与AMI组比较。

3 讨 论

AMI是常见的心血管疾病，病死率高，且发病机制复杂。目前研究表明，AMI的发病与炎性反应、免疫、细胞凋亡等相关。桔梗皂苷D是中药桔梗的主要成分[5-7]。研究表明，桔梗皂苷D能够调控凋亡相关蛋白表达而治疗肺癌和乳腺癌等肿瘤[8-10]，亦有研究表明桔梗皂苷D亦可调控大鼠体内的免疫细胞活性[11]。桔梗皂苷D是否可通过调控炎性反应、免疫、细胞凋亡等治疗AMI尚未有明确报道。本研究通过手术构建大鼠AMI模型，然后给予低、中、高剂量的桔梗皂苷D进行治疗，治疗后检测各组大鼠心脏功能，大鼠LVEDD和LVESD明显降低，LVFS和LVEF明显增加，说明桔梗皂苷D能够改善AMI大鼠心脏功能；且HE染色结果显示，桔梗皂苷D治疗后AMI大鼠心脏结构损伤被明显缓解，说明桔梗皂苷D能够治疗AMI大鼠心脏损伤。

AMI可促使心肌细胞因缺血缺氧而发生细胞凋亡，通过抑制心肌细胞凋亡可延缓心室重构并减少心肌梗死面积，既往研究报道指出心肌梗死后引发的心肌细胞凋亡是造成心力衰竭等心血管疾病发生的细胞学基础。所以，接下来本研究即探讨了桔梗皂苷D是否可通过缓解AMI大鼠心肌细胞的凋亡而缓解心肌损伤，本研究通过TUNEL检测心肌细胞凋亡，结果显示，桔梗皂苷D能够明显抑制AMI大鼠心肌细胞的凋亡。Bax、Bcl-2、caspase-3均为凋亡相关蛋白，其中Bax和caspase-3具有促进细胞凋亡的作用，而Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用[12]。且桔梗皂苷D治疗后促凋亡蛋白Bax和caspase-3表达明显下调，抑制凋亡蛋白Bcl-2表达明显上调，说明桔梗皂苷D能够通过调控凋亡相关蛋白的表达而调控AMI大鼠心肌细胞凋亡。

心肌梗死后多种原因可诱发心肌细胞凋亡，其中，AT1受体被激活后p53的表达增加，进而降低Bcl-2和Bax的比值从而发挥促进心肌细胞凋亡的作用[13]。CARP属于高度保守的肌肉锚定重复蛋白家族，主要在心脏中表达，且研究表明，CARP的表达能够随AT1受体激活而上调，提示AT1-CARP通路可能为引发心肌梗死后细胞凋亡的关键通路[14-15]。本研究表明，桔梗皂苷D治疗后，AMI大鼠心肌细胞AT1和CARP表达明显抑制，即AT1-CARP信号通路被明显抑制，说明桔梗皂苷D能够通过抑制AT1-CARP信号通路而缓解AMI大鼠心肌细胞凋亡。

综上所述，桔梗皂苷D能够改善AMI大鼠心脏功能及心肌损伤，其机制为通过抑制AT1-CARP信号通路而缓解AMI大鼠心肌细胞凋亡，但其临床应用还需进一步研究。