湖北后河国家级自然保护区短萼黄连的分子鉴定与分析

敖智广，韦乐华，杨 蕾，李 栋，李建斌，宋良科，廖 海，茆灿泉

(西南交通大学 生命科学与工程学院，成都 610031)

黄连(CoptischinensisFranch)又名味连、鸡爪连、川黄连等，为多年生草本植物，根状茎黄色，常分枝，密生多数须根；叶基生，坚纸质，卵状三角形，三全裂，中央裂片卵状菱形，羽状深裂，边缘有锐锯齿[1]。由于历史及各地民间用药习惯不同，黄连药材的植物来源比较复杂，涉及中国黄连属植物6个种、1个变种，分别为黄连(C.chinensis)、三角叶黄连(C.deltoidea)、云南黄连(C.teeta)、峨眉黄连(C.omeiensis)、五叶黄连(C.quinquefolia)、五裂黄连(C.quinquesecta)以及短萼黄连变种(C.chinensisvar.brevisepala)，其根茎均含有较多的小檗碱而可供药用。目前我国2015版药典收载的药材黄连基源植物是黄连、三角叶黄连以及云南黄连的干燥根茎[2]。市场销售均为人工栽培，罕有野生黄连。短萼黄连作为黄连的变种，传统的形态学、性状、显微和理化鉴定方法，效果和准确性较差。作为湖北后河国家级自然保护区新发现的野生黄连物种，有必要对其进行分子水平的鉴定，以确定其基原物种。

DNA条形码(DNA barcode)分子鉴定技术是利用基因组中一段公认的、相对较短和保守的DNA序列来进行物种鉴定的一种分子生物学技术，该技术几乎不受环境、被鉴定物形态等情况的影响，可以很好地弥补传统鉴定方法的不足[3-4]，以ITS2 序列为主、psbA-TrnH序列为辅的中药材分子水平鉴定方式已经被作为中药材DNA条形码鉴定原则的推荐方法之一，具有操作简易、专业技术要求不高、可批量操作、基因序列差异对比更准确，鉴定成功率高等优势[5-6]。DNA条形码技术目前已经在黄芩[7]、蛇床子[8]、石斛[9]、黄花紫堇[10]、重楼[11]等多种中药材鉴定中广泛应用，但对黄连属植物的研究较少。本研究以湖北后河国家级自然保护区野生黄连为研究对象，在形态学鉴定基础上，采用ITS2和psbA-TrnH组合，对其基原进行鉴定，以期为后河保护区黄连的种质资源保护及潜在开发利用提供基础。

1 材料和方法

1.1 样品材料

从湖北、四川、云南等不同地区采集12份黄连及其易混伪物种，分别将其编号为sample 1-sample 12。所有采集样本经西南交通大学生命科学与工程学院宋良科副教授进行形态学初步鉴定，鉴定结果见表1，样品保存于西南交通大学样品标本室。

表1 采集样本形态学鉴定结果

1.2 样品DNA提取、PCR扩增和测序

分别取12份样品干燥的叶片各50.0 mg，加入液氮研磨成粉。使用天根生化科技有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，确定样品DNA纯度后扩增ITS2和psbA-TrnH序列。ITS2引物碱基序列(5′-3′)为，F: ATGCGATACTTGGTGTGAAT，R:GACGCTTCTCCAGACTACAAT。psbA-TrnH引物碱基序列(5′-3′)为，F:GTTATGCATGAACGTAATGCTC，R:CGCGCATGGTGGATTCACAATCC。扩增体系为：正反引物各1.0 μL，TaqPCR MasterMix 12.5 μL，模板DNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃再延伸10 min。PCR产物使用质量分数为1%琼脂糖凝胶电泳法检测，然后将合格样品交由擎科生物科技有限公司进行双向测序，并参照《中药材DNA条形码分子鉴定指导原则》[5]判断测序峰图质量。

1.3 序列分析、NJ系统发生树构建、K2P距离计算以及ITS2二级结构预测

使用CodonCode Aligner 2.06(CodonCode Co., USA)进行序列拼接，对ITS2序列，根据Hidden Markov Model(HMM)模型，去除序列测序两端5.8S和28S基因区低质量序列，获得完整的ITS2基因间隔区序列；用ClustalX 2.1和MEGA 7.0 进行序列比对和基于K2P(Kimura 2-parameter)双参数模型的遗传距离分析，用邻接法(Neighbor joining，NJ)构建ITS2序列系统聚类树；对psbA-TrnH序列，根据中药材DNA条形码鉴定[12](http://www.tcmbarcode.cn/china/)确定psbA和trnH序列位置，使用软件将两段序列剪接，得到psbA-TrnH间隔区序列，在数据库中进行序列比对。通过ITS2 Database网站[12](http//its2.bioapps.biozentrum.uniwuerzburg.de/)的“Predict”功能进行ITS2序列二级结构预测。

2 结果与分析

2.1 物种ITS2序列差异及K2P遗传距离分析

共得到ITS2序列共82条, 其中12条为实验样本, 其余下载自NCBI,具体如表2所示, 不同样本ITS2间隔区的序列长度和GC含量差异较大。毛莨科黄连属7个物种间ITS2序列长度基本相近，为200～208 bp，且GC碱基平均含量差异不大，为65.34%～68.78%；高山唐松草和铁破锣虽然也属于毛莨科，但与黄连属相比，ITS2序列长度存在较大差异。与属间相比，黄连属内保持一定的相似性。与其他易混种相比，黄连属植株与白屈菜的ITS2序列长度最为接近，后者为209 bp；与箭叶淫羊藿的ITS2序列长度差别最大，后者为260 bp。14个物种中，样本GC含量最高的是岩黄连，为70.91%；含量最低的是铁破锣，为51.42%。

表2 不同物种ITS2间隔区的序列长度和GC含量

通过ITS2序列多样品比对，对黄连种内及其易混种间的K2P遗传距离进行分析。结果(表3)显示，黄连及易混种间的K2P平均遗传距离表现出明显差异，黄连种内平均K2P遗传距离为0.017，短萼黄连种内为0.008，黄连属间为0.051，毛莨科间为0.088，毛莨科与罂粟科间为0.462，毛莨科与小檗科间为0.479。

表3 基于ITS2序列黄连种内及其易混种间的K2P遗传距离

4条实验样本(Sample1、Sample2、Sample3和Sample7)和6条NCBI下载的黄连序列(KY780696.1，KY780694.1，KY780692.1，MF096173.1，KX984000.1，KX983996.1)比对结果表明：黄连种内有9个碱基突变位点，分别是66号T-C变异，121号T-A变异，135号G-A变异，142号C-T变异，159号T-A变异，166号G-A变异，186号T-C变异, 196号C-T变异和201号A-C变异(图1)；1条实验样本(湖北后河Sample12)和8条NCBI下载的短萼黄连序列(KY780746.1，KY780725.1，KY780724.1，JN862854.1，KY780747.1，KY780745.1，KY780744.1，KY780740.1)比对分析，表明短萼黄连种内有3个碱基突变位点，分别是70号C-T变异, 87号T-C/G变异以及130号A-G变异(图2)。

(a)、(b)和(c)分别为黄连1～70、71～140、141～206位点碱基序列，其中sample 1、sample 2、sample 3和sample 7为采集样本，其余序列下载自NCBI数据库

(a)、(b)和(c)分别为短萼黄连1～70、71～140、141～200位点碱基序列，其中sample 12为后河采集样本，其余序列下载自NCBI数据库

2.2 物种psbA-TrnH序列数据库比对结果

将12个样本的psbA-TrnH序列，放入中药材DNA条形码鉴定系统中进行序列比对，自动匹配出与目标序列最为接近的物种序列及相关信息。sample 1、sample 2、sample 3、sample 7、sample 8和sample 10与数据库中黄连最为接近，序列相似性为95.7%～98.2%；后河采集样本sample 12与数据库中三角叶黄连最为接近，序列相似性为97.5%，与短萼黄连相似性为93.6%；sample 4、sample 5和sample 6仅能鉴定为黄连属，与黄连属序列相似性为100%；sample 9与数据库中紫堇属最为接近，序列相似性为89.6%～96.0%；sample 11与唐松草属最为接近，序列相似性为94.4%～100%。

2.3 系统进化发育树

基于82个样本的ITS2序列，通过邻接法(NJ)构建系统发育树，结果如图3所示。黄连属及其易混伪种可以很好地区分开，整体分为3大支。峨眉黄连单独聚为一支；短萼黄连、日本黄连、黄连和云南黄连聚为一大类；高山唐松草、五裂黄连、白屈菜、铁破锣、三角叶黄连、箐边紫堇、箭叶淫羊藿以及黄疸树聚为一大类。采集的样本sample 1、sample 2、sample 3和sample 7和黄连聚为一支，bootstrap支持率为98%；sample 6和峨眉黄连聚为一支，bootstrap支持率为91%；后河采集样本sample 12和短萼黄连聚为一支，bootstrap支持为90%；sample 4和sample 5和三角叶黄连聚为一支，bootstrap支持率分别为100%和66%；sample 8和sample 10与箐边紫堇聚为一支，bootstrap支持率为99%；sample 9和sample 11单独聚为一支。以上结果是从分子进化角度进一步对分类进行了验证，揭示湖北后河国家级自然保护区野生黄连属于短萼黄连。

支上数值仅显示自展支持率≥50%

2.4 ITS2序列二级结构预测

在ITS2 database二级结构预测数据库中选取黄连及其7个易混品种，对其ITS2二级结构进行预测, 结果见图4。

(a)从左往右依次为黄连、岩黄连、峨眉黄连、高山唐松草；(b)从左往右依次为短萼黄连、三角叶黄连、五裂黄连、云南黄连

通过比对ITS2序列的二级结构，可以看出8个物种的ITS2二级结构较为相似，都符合具有一个主环、4个主臂、外加2个边环的特征，且在各主臂上有着大小、长度不一的茎、环结构。1号黄连的主臂为I、II、III和V，其中臂III最长，两个多分支环，臂上环总计17个。2号岩黄连ITS2二级结构主臂分别为I、II、III和V，其中主臂III最长，3个多分支环，臂上环结构总计16个。3号峨眉黄连主臂分别为I、II、III和V，其中臂III最长，两个多分支环结构，臂上的环结构总计12个。4号高山唐松草主臂分别为I、II、III和IV，其中臂III最长，两个多分支环结构，臂上环结构总计11个。6号三角叶黄连的主环明显比其他黄连近缘物种的ITS2序列二级结构的主环大。8号云南黄连的主要结构为一个主环，外加4个不大的主臂，结构明显区别于其他的黄连物种。云南黄连生存环境恶劣，推测其二级结构与其在片段化的居住环境中有关，云南黄连现已列为濒危物种。5号短萼黄连与7号五裂黄连的主臂与其他种属黄连的主臂不同，其他种属黄连的主臂有较多数量的环结构和多分支环，短萼黄连的多分支环为VI环和IV环，三角叶黄连为V环，五裂黄连的多分支环为V环，且五裂黄连主臂上的环结构更多、更大。

3 讨论

加拿大科学家 Paul Herbert于2003年提出了DNA条形码技术，在生物物种分类与鉴定研究领域得到了迅速应用。该技术利用短的、标准的 DNA 序列可为动植物来源的中药材提供快速、准确的鉴定[13]。中国药典2015版和中药材DNA条形码分子鉴定指导原则[5]指出，利用ITS2序列鉴定中药材植物的成功率高于psbA-TrnH序列。为此，本研究对于湖北后河自然保护区野生黄连的鉴定，在形态学初步鉴定的基础上，进一步采用了ITS2序列鉴定为主，psbA-TrnH序列鉴定为辅的策略。

经过ITS2多序列比对和K2P遗传距离分析，可以发现种内遗传距离明显小于种间遗传距离，属内遗传距离明显小于属间遗传距离，科内遗传距离明显小于科间遗传距离，表明了ITS2序列作为黄连属植株主要鉴定手段是准确可靠的。刘晓光[14]认为单一的ITS、matK、trnH-psbA和rbcL 4条片段仅能将黄连属4种1变种中的云南黄连与其他种区分开。李波等[2]研究发现多片段组合鉴定可以提高鉴定准确率，且能够有效区分中药黄连的原植物，即三角叶黄连、云南黄连和黄连。本研究12个采集样本的7个样本经psbA-TrnH序列数据库比对结果，与形态学鉴定、ITS2序列鉴定结果完全一致。短萼黄连作为黄连的变种，我们也将短萼黄连ITS2序列与黄连进行比对，结果发现很多碱基位点存在差异，表明黄连属间差异性显著大于种内，ITS2序列鉴定结果可靠。研究发现：后河样本sample 12通过ITS2序列鉴定，与形态学初步鉴定结果一致，均为短萼黄连；而作为辅助鉴定psbA-TrnH序列，只能鉴定其为黄连属植株，且与三角叶黄连最为接近。这与刘晓光[14]的研究结果一致，可能是由于黄连属植株psbA-TrnH序列保守性不如ITS2序列保守性以及测序的准确性有关。系统发育树结果显示：短萼黄连、日本黄连、黄连和云南黄连亲缘关系较近，且ITS能够很好地区分黄连及其变种短萼黄连；而五裂黄连和三角叶黄连和其他的易混品种不能很好地区分，如果采用更多的条形码片段组合加以鉴定，或许能够很好地解决这一问题。同时本研究还首次针对短萼黄连在内的7个近缘物种进行了ITS2二级结构预测，并对ITS2的二级结构进行分析，以期解决更高级分类时多序列比对困难问题[15]。研究结果显示：7个物种，短萼黄连与黄连的ITS2二级结构最为相似，与云南黄连的二级结构相差最远，并且三角叶黄连和五裂黄连与其他黄连属植株的ITS2结构存在显著差异，这也可能是导致进化树无法完全将其与岩黄连和白屈菜等易混物种区分开的重要原因。

短萼黄连和黄连同属国家三级保护植物，在中国植物红皮书中濒危级别为渐危。本研究表明对于黄连及其变种短萼黄连，无论是专家形态学鉴定，ITS2序列鉴定还是psbA-TrnH序列鉴定均能起到一定的作用，而将3种鉴定方法有机结合，能够更精准地鉴定相关物种[16-17]。成功鉴定了湖北后河新发现野生黄连物种为短萼黄连，不仅对湖北后河国家级自然保护区的物种发现与鉴定有着重要意义，而且也为保护区黄连种质资源的保护和合理开发利用提供必要的理论依据。

致谢:感谢湖北后河国家级自然保护区、中国林科院森林环保所的项目和工作支持。