七种竹叶品种挥发性化合物的统计学评价

韦杰,尹雅洁,,3,江伟,宋层业,魏灵,廖志力,韩兴林

1(四川省宜宾竹海酒业有限公司，四川 宜宾，644304) 2(中国食品发酵工业研究院，国家酒类品质与安全国际联合研究中心，北京，100015) 3(湖北师范大学 生命科学学院，食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室，湖北 黄石，435002)

竹叶是禾本科竹亚科植物的茎叶[1]，我国药用历史悠久。竹叶含有丰富的天然活性成分，如竹叶黄酮、竹叶多糖、内酯、氨基酸等[2-5]。我国竹叶资源极其丰富，由于竹叶的开发利用价值大，现已成为我国食品行业的新材料，如将竹叶提取物用于食品的保鲜[6]、开发竹叶保健饮料[7]等。近年来，竹叶在我国酿酒行业的应用十分广泛，竹叶提取物酿造黄酒能有效抑制发酵中产生的氨基甲酸乙酯[8]；以竹叶为酿造原辅料酿造浓香型竹酒[9]、清香型竹酒[10]、竹叶黄酒[11]、麻竹竹酒[12]等保健酒功效显著。然而，随着竹酒的开发，竹叶挥发性成分以及竹叶品种差异对竹酒风味的影响尚不清楚。因此，以竹叶为起点，研究不同品种竹叶的原始自然风味成分，可为后期竹类饮料或饮料酒的研究提供理论依据。

GC-MS是一种高效快速、准确度高、灵敏度大的分离分析技术，在食品、环保、生物等领域广泛应用[13-16]，目前，已经应用于鉴定竹叶中的挥发性成分[17-18]。而气相色谱-质谱联用结合固相微萃取技术(headspace solid phase micro extraction-GC-MS,HS-SPME-GC-MS)能一次性对复杂的混合物样品进行分离、定性及定量分析。本文采用HS-SPME-GC-MS技术对麻竹、黄竹、绵竹、箭竹、慈竹、苦竹及斑竹叶7种竹叶的挥发性物质进行定性定量分析，并结合统计学分析竹叶品种差异，为今后不同香型、不同品种竹酒风味的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

共收集了7种不同品种竹叶，经鉴定分别为麻竹(DendrocalamuslatiflorusMunro)、黄竹(DendrocalamusmembranceusMunro)、绵竹(Lingnaniaintermedia)、箭竹(FargesiaspathaceaFranch)、慈竹(Neosinocalamusaffinis)、苦竹(Pleioblastusamarus)及斑竹(Phyllostachysbambusoidesf.lacrima-deae)。

乙酸乙醇、乙醇、芳樟醇、罗勒烯等色谱纯标准品，赛默科有限公司；正构烷烃(C8～C40)混标 标准品(色谱纯,质量浓度 0.5 mg/mL)，国家标准品网整理提供。

1.2 仪器与设备

ST180-A苏格电磁炉，广东省中山市苏格电器有限公司；Clarus 600型GC-MS联用仪，美国PerkinElmer公司；HH-1数显电子恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司；固相微萃取进样器、固相微萃取柱(50/30 μm，DVB/CAR/PDMS)，美国Supelco 。

1.3 实验方法

1.3.1 样品前处理

粉碎竹叶样品，称取3 g粉碎样品于20 mL萃取瓶中，加盖密封置于40 ℃水浴锅中平衡15 min，采用固相微萃取吸附40 min后插入气相色谱进样口，250 ℃条件下解析5 min。

1.3.2 GC-MS分析条件

气相色谱条件：DB-WAX ETR型色谱柱 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱温箱升温程序：初始温度35 ℃，恒温2 min，以4 ℃/min升至230 ℃，保持7 min。进样口温度为250 ℃，载气为He，流速为1.0 mL/min，不分流。

质谱条件：电子轰击(electron impact, EI)离子源，电子能量70 eV，传输线温度240 ℃，离子源温度240 ℃，质量扫描范围m/z55～500。

1.3.3 化合物定性

通过质谱软件处理化合物在GC-MS上的采集信息。首先，将分离的每1个色谱峰采用NIST谱库2.2进行检索和比对，当质谱库计算机检索出物质与样品中物质的匹配度高于90%时，再结合实际保留指数和参考保留指数的相近度，确定每1个色谱峰的物质种类。

“真的啊？那你可是我女儿的学长咯，她年底就要来悉尼大学报到了。”提到她女儿时，她的眼里如同能放出光芒般神采飞扬。“她学习成绩可好了，省重点熊猫班前三……”

1.4 数据处理

采用Excel 2010对数据进行汇总和制图；采用SPSS 21.0对数据进行显著性分析(每组数据3次平行)以及主成分分析(principal component analysis, PCA)和聚类分析(cluster analysis, CA)。

2 结果与分析

2.1 不同品种竹叶的GC-MS图谱分析

不同品种的竹叶样品采用GC-MS检测得到总离子流图(图1)。通过NIST谱库2.2检索、保留指数针对指纹图谱进行物质种类的鉴定。由于竹叶的挥发性主体和微量成分众多，且各种挥发性物质的含量差别非常显著，因此除对样品进行挥发性物质的分析鉴定之外，还要针对所有物质的相对含量进行深入地分析和研究。

a-斑竹;b-苦竹;c-慈竹;d-箭竹;e-绵竹;f-黄竹;g-麻竹图1 七种竹叶的质谱总离子流图谱Fig.1 Mass spectrometric total ion flux spectrum of seven kinds of bamboo leaves

2.2 七种竹叶的挥发性物质鉴定结果

7种品种的竹叶共检测出142种挥发性成分，其中每一类占比较高的挥发性化合物共计46种详细列出了相关的鉴定信息，结果如表1所示。不同品种竹叶在挥发性成分上差异较大，己醛、顺-2-己烯醛、甲基庚烯酮、癸酸甲酯等10种挥发性成分在7种竹叶中均有检出；芳樟醇、α-紫罗酮、乙酸等在6个竹叶品种中检测出，部分挥发性成分为个别竹叶特有的物质，如罗勒烯仅在麻竹叶中检出，叶醇仅在黄竹叶中检出。

2.3 七种竹叶的挥发性物质对比分析

2.3.1 竹叶的化合物数量分析

针对7种竹叶的挥发性物质数量进行统计分析，见图2。7种竹叶检测出的化合物在种类上略有差异，但并不显著。7种竹叶均具有图2中的九大类物质，说明7种竹叶在挥发性化合物的种类方面具有较强的稳定性和一致性。但不同品种的竹叶其挥发性物质在数量上存在差异，麻、黄、绵、箭、慈、苦及斑竹叶分别检测出71、52、51、62、63、52及53种挥发性成分。

图2 七种竹叶中化合物数量的分类统计结果Fig.2 Statistical results of the number of compounds in seven kinds of bamboo leaves

2.3.2 竹叶中各类化合物相对含量分析

以每种化合物的峰面积占所有化合物的峰面积总和的比例作为该化合物的相对含量,进一步对7种竹叶的挥发性化合物相对含量进行分析，如图3所示。7种竹叶中各类挥发性物质的相对含量从高到低分别为烃类(13.66%～44.00%)，醛类(19.08%～37.18%)，醇类(13.65%～30.85%)，酮类(6.38%～16.33%)，酯及内酯(5.67%～14.35%)，萜类(0～11.18%)，酸类(0.68%～6.72%)，芳香类(0.29%～6.24%)，醚类(0～3.91%),杂环类(0～1.01%)。此外，7种竹叶在挥发性物质含量上存在显著差异，箭、慈竹叶中烃类物质占比较大，分别为44.00%、30.68%；斑竹叶中醛类物质相对含量较高，为37.18%；而黄竹和苦竹叶中醇类物质占比较大，分别为24.07%、30.85%。

图3 七种竹叶的化合物相对含量的统计分类结果Fig.3 Statistical classification results of the relative contents of seven kinds of bamboo leaves

竹叶的挥发性化合物较多，主要选取醛类、酮类、酯及内酯、醇类和萜类5类与竹酒风味及功效密切相关的化合物进行下一步分析。以每种化合物的峰面积占其所在类别的总峰面积的比例作为该物质的相对含量。选取每类化合物相对含量较高的3种物质进行分析，结果见图4。竹叶具有独特的清香，这种芳香成分是天然香料的重要来源，能赋予竹酒特别的竹香。醛类物质是竹叶芳香成分的基础，不同的竹叶所含有的醛类物质含量和组成不同[19-20]。竹叶芳香成分中醛类物质以顺-2-己烯醛为主，顺-2-己烯醛为淡黄色液体，具有新鲜绿叶的清香，能调配食用香精[21]。李翔等[21]在麻竹叶挥发油成分中发现9种醛类,占挥发油总含量的21.37%；其中顺-2-己烯醛是挥发油的重要成分，占比14.62%，与本研究结果类似。7种竹叶中醛类物质含量较高的为顺-2-己烯醛，在不同品种竹叶中相对含量分别为30.74%(麻竹叶)、62.26%(黄竹叶)、35.63%(绵竹叶)、52.24%(箭竹叶)、32.61%(慈竹叶)、26.14%(苦竹叶)、42.43%(斑竹叶)。

醛-1：顺-2-己烯醛；醛-2：藏红花醛；醛-3：苯甲醛；酮-1：α-紫罗酮；酮-2：β-紫罗酮；酮-3：甲基庚烯酮；酯-1：癸酸甲酯；酯-2：1H-四唑-5-乙酸乙酯；酯-3：二氢猕猴桃内酯；醇-1：苯乙醇；醇-2：苯甲醇；醇-3：2,3-丁二醇；萜-1：芳樟醇；萜-2：α-法呢烯；萜-3：反式-橙花叔醇图4 七种竹叶中挥发性物质的统计分类结果Fig.4 Statistical classification results of volatile substances in seven kinds of bamboo leaves

此外，藏红花醛仅在麻竹叶(17.69%)、绵竹叶(16.14%)、慈竹叶(14.75%)中检出。而苯甲醛在苦竹叶(31.01%)和慈竹叶(26.57%)中相对含量较高。不同品种的竹叶在醛类成分上大致相同，但由于个别物质的差异使每种竹叶具有独特的竹叶芳香，可用于开发具有独特清香的不同品种的竹酒。

酮类物质不仅是竹叶芳香的来源,还是多种风味物质的中间体。酮类物质中α-紫罗酮和β-紫罗酮呈现紫罗兰香气，能较好地协调竹叶的其他芳香成分，促进竹叶特殊香气的平衡。甲基庚烯酮具有柠檬草和乙酸异丁酯般的香气，是医药、香料的重要中间物质。7种竹叶中α-紫罗酮(0～53.33%)在绵竹叶(53.33%)、苦竹叶(52.65%)中相对含量较高，但α-紫罗酮在黄竹叶中未检出。每种竹叶的β-紫罗酮(19.85%～26.92%)相差不大，而甲基庚烯酮在斑竹叶(27.91%)和箭竹叶(26.94%)中含量较高(图4)。竹叶的酮类物质不仅能平衡协调其主体芳香，更是不可忽视的活性成分。

酯类物质具有令人愉悦的花香和水果香气，对竹叶香气具有重要贡献。内酯类物质的香气和其对应的酯类物质类似，是不可忽视的香气成分。酯类及内酯类物质的香气怡人、留香持久，可能成为竹酒中不可或缺的一类呈香物质。如图4所示，7种竹叶中的酯及内酯类物质在种类及相对含量上差异较大，其中癸酸甲酯(23.84%～49.96%)、二氢猕猴桃内酯(3.98%～19.67%)在7种竹叶均有检出，是7种竹叶最主要的酯及内酯类物质。而1H-四唑-5-乙酸乙酯仅在麻、慈、苦竹叶中检出，在麻竹叶中(24.84%)相对含量最高。

醇类物质是竹叶中占比较高的物质，也是竹酒的主要呈香呈味物质。此外，醇类物质还具有一定的抑菌效果。由图4可知，7种竹叶中的醇类物质在种类及相对含量上差异较大，苯乙醇(玫瑰花香)是主要的醇类物质，在黄竹叶中(75.65%)含量最高；其次是苯甲醇(芳香味)，在绵竹叶(23.26%)含量最高；而2,3-丁二醇仅在麻竹叶(13.15%)和慈竹叶(39.92%)中检出。不同品种竹叶醇类物质的差异可能会导致竹酒风味的差异。

萜类物质广泛存在于高等植物中，是构成植物香精、色素等的挥发性成分，同时具有各种有益人体健康的抗性活性成分。竹类植物中含有的大量萜类物质香气丰富，能协调竹叶风味的整体性。如图4所示，芳樟醇是最主要的萜类物质，相对含量分别为39.12%(麻竹叶)、52.55%(黄竹叶)、96.95%(绵竹叶)、100%(箭竹叶)、92.28%(慈竹叶)、75.18%(斑竹叶)，苦竹叶中未检测到萜类物质。芳樟醇带有铃兰花香和木香，但随来源不同而香气各异，在香料、香精中广泛存在。此外，芳樟醇还具有抗菌、抗病毒、杀虫驱虫的药理作用[22]。本研究中发现6种竹叶中含有大量的芳樟醇，证明竹叶的萜类活性成分含量较高，更好地丰富了竹酒的功效。另外，α-法呢烯(花香)在麻竹叶(39.05%)中含量最高，反式-橙花叔醇在斑竹叶(24.82%)中含量最高。

2.4 主成分分析和聚类分析

2.4.1 主成分分析

为进一步明确不同品种竹叶间的差异，以7种竹叶样品为分析对象，采用主成分分析对10大类别的挥发性成分进行分析。结果如图5所示，3个主成分中，第1成分反映34.52%的数据信息，第2主成分反映23.25%的数据信息，3个主成分累积反映73.52%的数据信息。由图5可知，酯及内酯类物质和芳香类物质在PC1上距离较近，对PC1正向贡献较大；酸类、萜类物质对PC2正向贡献较大；醇类物质对PC3的正向贡献较大。

图5 七种竹叶主成分分析结果Fig.5 PCA results of seven kinds of bamboo leaves

2.4.2 聚类分析

采用离差平方和法将7个品种竹叶的所有挥发性物质数据进行聚类分析，结果如图6所示，在距离为10处可将竹叶分为3大类，第1类为箭竹叶、苦竹叶、斑竹叶；第2类为黄竹叶；第3类为麻竹叶、绵竹叶、慈竹叶。结果表明，黄竹叶与其他6个品种竹叶挥发性成分差异性较大，箭、苦、斑竹叶挥发性成分相似；麻、绵、慈竹叶挥发性成分差异不大。聚类分析能有效地通过挥发性成分对竹叶进行分类，同时也反映出不同品种的竹叶在挥发性物质上存在一定差异，竹叶品种的差异可能导致开发的竹酒品质差异较大。

图6 七种竹叶聚类分类结果Fig.6 CA analytical diagram of seven kinds of bamboo leaves

3 结论

采用HS-SPME-GC-MS分析研究了7种不同品种的竹叶，通过谱库进行检索和保留指数验证，共鉴定出142种挥发性物质，主要包括醛类、酮类、醇类、酯类、萜类、酸类等大多数品种竹叶共有的化合物。而每种竹叶中检测出的挥发性化合物种类为麻竹叶(71种)>慈竹叶(63种)>箭竹叶(62种)>斑竹叶(53种)>黄竹叶(52种)、苦竹叶(52种)>绵竹叶(51种)。7种不同品种的竹叶在化合物种类上差异不显著，但各类化合物的相对含量差异较大，箭、慈竹叶中烃类物质占比较大，分别为44.00%、30.68%；斑竹叶中醛类物质相对含量较高，为37.18%；而黄和苦竹叶中醇类物质占比较大，分别为24.07%、30.85%。

本研究7种竹叶检测到的挥发性化合物中醛类物质以顺-2-己烯醛(26.14%～62.26%)、苯甲醛(10.70%～31.01%)相对含量较高；酯及内酯类物质主要包括癸酸甲酯(23.84%～49.96%)、二氢猕猴桃内酯(3.98%～19.67%)；酮类物质相对含量较高的为α-紫罗酮(0～53.33%)、β-紫罗酮(19.85%～26.92%)；醇类物质中,苯乙醇(18.42%～75.65%)、苯甲醇(5.65%～23.26%)相对含量较高，萜类物质以芳樟醇(39.12%～100%)的相对含量最高。

HS-SPME-GC-MS结合主成分分析、聚类分析较好地对竹叶品种进行区分，挥发性物质含量的差异可以反映出竹叶的品种差异，本研究中黄竹叶与另外6个品种竹叶挥发性差异较大，箭、苦、斑竹叶挥发性相似,麻、绵、慈竹叶挥发性差异不大，竹叶品种的差异可能导致竹酒的挥发性差异较大。本研究主要对竹叶的挥发性进行鉴定和对竹叶品种进行区分，通过对竹酒原材料的深入研究为下一阶段研究不同香型、不同种类竹酒的挥发性提供一定的指导作用。