咳嗽变异性哮喘患儿外周血miR-155、SOCS-1表达变化与Th1/Th2失衡的关系

李雯，赵伟伟，葛建敏，吴俊峰，董建芳

张家口市第一医院，河北张家口075000

咳嗽变异性哮喘（CVA）是一种以咳嗽为主的不典型哮喘，具有与典型哮喘类似的临床和病理生理特征，如季节性咳嗽、气道高反应性、嗜酸性气道炎症和气道重塑等。CVA 是导致儿童慢性咳嗽的主要原因，部分患者可进展为典型哮喘［1］。CAV 存在辅助型T 细胞1（Th1）/辅助型T 细胞2（Th2）失衡，表现为以Th2 为主的免疫反应。Th2 相关细胞因子可诱导炎性介质释放，导致局部气道炎性细胞浸润［2］。微小RNA 是一类小编码RNA，在细胞增殖、炎性反应、免疫调节等病理生理过程中发挥重要作用［3］。微小RNA-155（miR-155）是一种多功能性非编码蛋白RNA，其表达与癌症发展、炎症反应和免疫稳态有关，参与Th2 相关免疫应答［4］。细胞因子信号转导蛋白抑制蛋白1（SOCS-1）是一种通过抑制Janus激酶（JAK）/转录信号转导器和激活因子（STAT）来调控细胞因子信号转导的调节因子，在免疫反应中发挥调控作用［5］。SOCS-1在活化单核细胞中异常表达，诱导M2 巨噬细胞分化，参与过敏性哮喘的发生发展［6］。因此，本研究拟探讨 miR-155、SOCS-1 与CVA 患儿Th1/Th2 失衡的关系，以期为临床CVA 治疗提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择 2018 年 3 月—2020 年 6 月本院收治的103 例CVA 患儿（CVA 组），纳入标准：①具有典型CAV 症状，符合2013 版《中国儿童慢性咳嗽诊断与治疗指南》中CAV诊断标准［7］；②病程大于1 个月；③肺功能正常。排除标准：①慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张、肺结核、肺部感染等疾病；②过敏性疾病、免疫性疾病、感染性疾病；③近1 个月服用免疫抑制剂；④合并恶性肿瘤。其中男59 例、女44例，年龄 2～12（7.25 ± 2.16）岁，有哮喘家族史 42例，过敏体质21 例，IgE 阳性53 例。另选择同期本院儿科保健门诊接诊的72例健康儿童为对照组，均经门诊体检排除呼吸道感染、哮喘、高血压、糖尿病、免疫性疾病等。其中男39 例、女33 例，年龄2～11（7.93 ± 2.04）岁。两组性别、年龄比较差异无统计学意义（P均>0.05）。受试儿童法定监护人均签署知情同意书。本研究获得医院医学伦理委员会批准。

1.2 外周血miR-155、SOCS-1 mRNA 表达检测 采用RT-PCR 法。采集两组空腹静脉血5 mL，注入EDTA 抗凝管，4 ℃ 3 000 r/min 离心 20 min（离心半径10 cm），分离血浆，-80 ℃保存备用。室温复融血浆样本，采用TRIzol 试剂（美国Ambio 公司）提取总RNA，采用 CFX96 实时荧光PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）M-MLV 逆转录酶（Epicentre 公司）进行RT-PCR，将总RNA转录为cDNA。反转录体系共18 μL，包括RNA 模板 5 μL，OligodT 1 μL，反转录酶（50 U/μL）1 μL，RNA 酶 抑 制剂（20 U/μL）0.5 μL，dNTPs（100 mmol/L）1 μL，Buffer 液1.5 μL，DEPC 水5 μL，U6及miRNA引物3 μL。引物合成及序列测定由上海基康公司完成。miR-155 上游引物5'-CGTTAATGC⁃TAATCGTGATAG-3'，下 游 引 物 5'-GCAGGGTCC⁃GAGGT-3'；SOCS-1 上 游 引 物 5'-AGACCCCTTCT⁃CACCTCTTG-3'， 下 游 引 物 5'-CTGCACAG⁃CAGAAAAATAAAGC-3'；U6上游引物5'-CTCGCTTC⁃GGCAGCACA-3'，下 游 引 物 5'-AACGCTTCAC⁃GAATTTGCGT-3'。反应条件：95 ℃预变性10 s，65 ℃变性 20 s；75 ℃退火15 s，共40 个循环。扩增条件：95 ℃预变性 10 min，95 ℃变性 15 s、60 ℃退火 60 s，45 个循环，共进行 3 次平行试验。用 2-ΔΔCt法计算miR-155、SOCS-1 mRNA相对表达量。

1.3 外周血Th1、Th2 及其相关细胞因子检测 采集两组肘静脉血6 mL，一份注入EDTA 抗凝管混匀检测Th1、Th2，一份注入干燥试管检测相关细胞因子。取100 μL 血液标本注入流式检测管，加入Per⁃CP-小鼠抗人CD4 单克隆抗体IgG，室温避光孵育30 min，加入 2 mL 红细胞 lysis Buffer 混匀，室温避光孵育10 min，300 g 离心5 cm（离心半径10 cm）弃上清，用2 mL 磷酸盐缓冲液洗涤。加入PerCP-抗CD3和PE-抗CD8抗体，再次离心洗涤，加入500 μL磷酸盐缓冲液重悬细胞，制成外周血单个核细胞液悬液（1×104/mL）。用 EPICS-XL 流式细胞仪检测 Th1、Th2 细胞比例，计算Th1/Th2。干燥试管血标本置于安徽中科中佳台式离心机KDC-1044L 进行离心处理，离心半径为15 cm，离心速率3 000 r/min，离心时间为10 min，取血清-80 ℃保存。采用酶链免疫吸附试验检测Th1 细胞分泌的干扰素（IFN-γ）、白细胞介素2（IL-2）及Th2 细胞分泌的IL-4、IL-10。试剂盒购自上海透景生命科技股份有限公司。

1.4 统计学方法 采用SPSS25.0 统计软件。计量资料用±s表示，比较采用独立样本t检验。各指标之间的相关性分析采用Pearson 相关。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组外周血miR-155、SOCS-1 mRNA 表达比较 CVA 组外周血 miR-155、SOCS-1 mRNA 相对表达量高于对照组（P均<0.05），见表1。

表1 两组miR-155、SOCS-1 mRNA表达比较（±s）

表1 两组miR-155、SOCS-1 mRNA表达比较（±s）

组别CVA组对照组t P n 103 72 miR-155 1.32±0.42 0.39±0.05 22.697<0.05 SOCS-1 mRNA 1.21±0.32 0.25±0.06 29.486<0.05

2.2 两组 Th1、Th2、Th1/Th2 及其相关细胞因子比较 CVA 组 Th2 比例及 IL-4、IL-10 水平高于对照组（P均<0.05），Th1 比例、Th1/Th2 及 INF-γ、IL-2 水平低于对照组（P均<0.05），见表2、3。

表2 两组Th1、Th2及Th1/Th2比较（±s）

表2 两组Th1、Th2及Th1/Th2比较（±s）

组别CVA组对照组t P n 103 72 Th1（%）3.62±0.72 6.42±2.13 12.453<0.05 Th2（%）3.31±2.09 1.39±0.42 13.697<0.05 Th1/Th2 1.09±0.27 4.76±1.51 23.925<0.05

表3 两组相关细胞因子水平比较（pg/mL，±s）

表3 两组相关细胞因子水平比较（pg/mL，±s）

组别CVA组对照组t P n 103 72 INF-γ 46.35± 9.59 62.35±15.49 8.782<0.05 IL-2 32.15± 6.28 52.35±13.49 13.575<0.05 IL-4 46.35±9.35 20.21±3.56 5.997<0.05 IL-10 26.35±5.15 13.43±4.23 19.386<0.05

2.3 CVA 组外周血 miR-155、SOCS-1 mRNA 表达与Th1、Th2、Th1/Th2 及相关细胞因子的相关性 CVA组患者外周血miR-155 表达与SOCS-1 mRNA 表达呈 正相 关（r=0.612，P<0.05）。CVA 组 外 周 血miR-155、SOCS-1 mRNA表达与Th2比例、IL-4、IL-10呈正相关（P均<0.05），与Th1比例、Th1/Th2、INF-γ、IL-2均呈负相关（P均<0.05）。见表4。

3 讨论

CVA 是典型哮喘的前驱症状，患儿临床仅表现为咳嗽，无喘息或呼吸短促，肺功能正常，但是CVA患儿可出现呼吸道嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润、平滑肌痉挛、气道高反应性和呼吸道重构［7］。CVA 患儿对抗生素治疗无反应，但传统哮喘治疗有效，被认为是特殊表型的哮喘，30%～40%的CVA 可发展成为典型哮喘，严重影响肺功能［8-9］。哮喘患者存在显著的Th1/Th2 失衡，Th2 亚群占优势易引起IgE 血症、嗜酸性粒细胞增多症，在哮喘发病过程中发挥关键作用［10-11］。CVA 与典型哮喘发病机制大致相同，Th1/Th2失衡引起的Th2优势应答可能是其重要的免疫学发病机制［12］。

表4 CVA组外周血miR-155、SOCS-1与Th1、Th2、Th1/Th2及相关细胞因子的相关性

Th1、Th2 细胞分化和平衡调节通过细胞内转录、信号途径实现。miRNA 在免疫细胞发育分化中起调控作用，其异常表达可能导致免疫紊乱［13］。miR-155来源于B细胞整合簇，在人胸腺、脾脏、肺等富含免疫细胞器官中高表达，在Th 细胞分化、细胞因子生成、免疫监管中发挥重要作用［14］。miR-155与免疫系统疾病发病密切相关。现有研究显示，miR-155 在免疫性血小板减少症患者中表达上调，与 B 淋巴细胞功能相关［15］，miR-155 在过敏性紫癜患者表达升高，参与调节过敏性气道炎症反应以及IL-33信号传导［16］。miR-155与哮喘的发生也有着密切的关系，在介导T 细胞过敏性炎症反应中发挥作用［17］。本研究发现，miR-155 在 CVA 患儿中表达增高，且 miR-155 表达与 Th2 比例、IL-4、IL-10 呈正相关，与Th1、Th1/Th2、INF-γ、IL-2 呈负相关，说明Th1/Th2 与CVA 患儿Th1/Th2 失衡有关。相关报道指出miR-155参与T细胞免疫反应和相关细胞功能，过表达 miR-155 可促进 IFN-γ 诱导的 Th1 细胞分化，促进IL-4 诱导的 Th2 表型，miR-155 缺失是导致 Th2 活化受损的主要原因［4］。转移相关肺腺癌转录本1（MALAT1）可抑制CD4+T 细胞中miR-155 表达，细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4（CTLA-4）是 MALAT1 上游调节因子，CTLA-4/MALAT1/ miR-155 轴参与Th1/Th2平衡调节［18］。以上结果提示，miR-155是CVA患儿Th2相关变态反应性疾病的关键介质。

SOCS-1是细胞因子信号转导的负性调节因子，经 IL-6 刺激 M1细胞后诱导 STAT3 活化，SOCS-1 通过与JAK 催化域JH1 区络氨酸残基结合反馈性调控 JAK/STAT 信号通路，影响细胞增殖分化［19］。SOCS-1 还可通过toll 样受体（TLR）促效剂阻断TLR信号转导，参与多种免疫反应调控［20］。现有报道显示SOCS-1 参与儿童过敏性紫癜T 辅助17 细胞/调节性T 细胞失衡调节过程［21］，与哮喘发病也密切相关［22］。本研究发现，SOCS-1 在 CVA 患儿中表达升高，且其表达与Th1/Th2失衡有关，说明SOCS-1参与了Th1/Th2 的调控过程。机体在抗原刺激下JAK/STAT信号通路活化，促使SOCS-1表达，SOCS-1负向调控细胞因子信号转导，调控Th1/Th2 处于动态平衡中，维持机体免疫稳态，SOCS-1 调控异常可引起Th1/Th2 失衡［23］。SOCS-1 参与 CVA 患儿 Th1/Th2 失衡的机制可能为：CVA 局部气道炎症反应诱导IL-6分泌增加，IL-6 通过 JAK/STAT 途径诱导 SOCS-1 表达抑制Th1相关细胞因子IFN-γ分泌；另一方面通过Ras 蛋白/细胞外信号调节激酶/丝裂原活化蛋白激酶途径活化T 细胞核因子2，促使IL-4 介导的Th2 细胞分化。说明SOCS-1 可干扰IFN-γ 信号途径抑制Th1 分化，激活IL-4 信号途径促使Th2 细胞优势活化，导致Th1/Th2失衡［24］。

本研究中miR-155 与SOCS-1 表达呈正相关，说明 miR-155、SOCS-1 在 CVA 患儿 Th1/Th2 失衡中发挥作用。研究显示，SOCS-1 是miR-155 的靶点，miR-155可调控SOCS-1表达，二者参与小胶质细胞炎症反应、氧化应激和免疫反应［25］。miR-155/SOCS-1轴在登革病毒感染介导的宿主免疫反应中发挥重要作用［26］。以上结果提示，miR-155/SOCS-1 轴参与CVA患儿Th1/Th2失衡过程。miR-155、SOCS-1可直接调控T 淋巴细胞分化，也可通过miR-155/SOCS-1轴抑制Th1 细胞分化，促使Th2 优势反应，进而诱导CVA发生和进展。

综上所述，CVA 患儿外周血miR-155、SOCS-1呈高表达，miR-155、SOCS-1 可能参与了 CVA 患儿Th1/Th2 失衡过程。由于Th1/Th2 调控机制复杂，miR-155、SOCS-1 在 CVA 患儿 Th1/Th2 失衡中的调控机制尚待更多基础研究和体外研究证实。