铯-137γ射线辐射对郁金香鳞茎的诱变效应

黑银秀，刘君，郭方其，江景勇

（1.台州市农业科学研究院，浙江 台州 3170002；2.浙江省农业科学院 园艺所，浙江 杭州 310021）

郁金香Tulipa gesneriana是百合科Liliaceae郁金香属Tulipa多年生鳞茎植物，是世界著名的球根花卉。近年来，国内的一些植物园和花海展区从荷兰进口的郁金香商品种球的品种和数量在逐年增多[1-3]，种球严重依赖国外进口。辐射诱变育种具有变异频率高、变异幅度大、育种周期短等特点，是当前无性繁殖植物育种的主要方法之一。全世界采用该技术已在营养繁殖植物中育出465个突变品种，其中，大多数是花卉植物，包括菊花Chrysanthemum × morifolium、大丽花Dahlia pinnata、玫瑰Rosa rugosa等[4]。γ射线辐射诱变技术在我国花卉育种中已取得显著成果，菊花[5-6]、月季的诱变新品种在所有观赏植物中首屈一指[7]。另外，水仙Narcissus tazettavar.chinensis.[8]、唐菖蒲Gladiolus hybridus[9-10]、莲Nelumbo nucifera[11]、香雪兰Freesia refracta、王百合Lilium regale[12]等多种花卉经辐射后均获得了突变品种。早在上个世纪80年代，荷兰De Mol等首先进行了郁金香辐射育种研究[13]，许多受欢迎的郁金香品种，如‘Murillo’‘William c opland’‘Bartigon’等就是通过突变的方法选育出来的[14]。近十余年来，国内关于郁金香的研究主要集中在郁金香的引种与栽培[15-16]、低温处理与花期调控[17-18]、鳞茎发育和再利用[19-20]、杂交育种[21-22]等方面。为研究辐射对郁金香鳞茎的诱变效应，本研究以郁金香鳞茎为供试材料，探讨了铯-137γ射线不同辐射剂量对鳞茎的花芽分化、出苗率、蕾期及开花性状的影响，确定了辐射的半致死剂量，以期为郁金香辐射诱变育种适宜剂量的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间和地点

2018年6月至2019年4月，在浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所进行辐射处理，在台州市农业科学研究院基地进行栽培和结果调查。

1.2 试验方法

本文在前期预试验中用铯-137γ射线40 ～100 Gy进行郁金香花芽分化期辐射试验，结果发现所有经辐射处理的种球在冷藏期鳞茎根盘均没有突起迹象，播种1周后没有发根，播种2周后芽仍未出土，后期鳞茎全部腐烂死亡，而对照（无辐射处理）的生根、出苗、开花则表现正常，说明40 G y已经远远超过了郁金香花芽分化期鳞茎的致死剂量。因此，本次试验选择5～30 Gy进行试验。

供试郁金香鳞茎于2018年3月在台州市黄岩区蓝美庄园基地收获；试验品种有‘红牌’‘Red Label’、‘杨范内斯’‘Jan van nes’、‘白雪公主’‘Royal virgin’；鳞茎大小：周径大于10 cm；辐射时期：2018年6月5日（花芽分化前）；辐射源：铯-137(137Cs) γ射线；剂量率：1 Gy·min-1。试验每个品种设置5个处理：0 Gy(CK)、5 Gy、10 Gy、20 Gy、30 Gy，每个处理3次重复，每个重复鳞茎数量为100个。

1.3 鳞茎储藏方法

2018年4-8月，控制储藏室温度不高于22℃、相对湿度在65%±2%；9-11月，温度为5±0.5℃。6月5日进行辐射处理，辐射处理后，种球仍放回储藏室，每月取样1次，每次每个处理取样3个鳞茎进行解剖。

1.4 田间栽培方法

于2018年12月1日低温处理完成后，挑选无病虫害的鳞茎，种植于温室中，调查统计辐射后各处理鳞茎的生根、出芽及开花情况。

1.5 指标测定方法

芽长：将鳞茎外层鳞片剥掉，露出中心芽体，用游标卡尺测量中心芽体的长，取平均值。

鳞茎生长点切片方法：将鳞茎外层鳞片剥掉，露出中心芽体，对生长点进行切片，在立体显微镜下观察花芽的分化情况并拍照。

田间地栽试验采用计数法和直尺测量法。

1.6 数据处理

试验数据采用Excel和SPSS软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 辐射对郁金香鳞茎中心芽体生长的影响

由图 1表明，‘红牌’ 和‘杨范内斯’两个品种的鳞茎经辐射处理后其中心芽的生长均受到抑制，生长变缓。随着鳞茎储藏时间的延长，中心芽逐渐伸长；随着辐射剂量的增大，中心芽的芽长越小，被抑制作用越明显。两个品种不同辐射处理鳞茎中心芽的生长趋势相同。由图2可看出，和CK相比，5～30 Gy辐射处理明显抑制郁金香鳞茎中心芽的生长，辐射剂量越大，抑制作用越明显。

图1 辐射对中心芽生长的影响Figure 1 Effect of radiation on the growth of central buds of different cultivars

2.2 辐射对郁金香花芽分化的影响

2.2.1 辐射对‘红牌’花芽分化的影响 辐射后5个月对‘红牌’中心芽体切片进行观察，结果见图 3。由图3 可知，CK的花器官结构发育完整，可明显看到3个外轮花瓣、3个内轮花瓣、6个雄蕊及三棱形的雌蕊，且每个花药具4个花粉囊，花粉囊呈圆形且明显鼓起。花药横截面面积越来越大，截止到11月29日花药的横截面面积与柱头横截面面积接近。说明CK的花芽分化整个阶段已经完成。10 Gy、20 Gy、30 Gy处理花芽分化速度迟缓，花药还未形成明显的4个花粉囊，且单个花药的横截面面积明显小于柱头的横截面面积。其中，5 Gy处理花瓣结构发育完整，雄蕊虽然有6个花药，但其中两个花药仅有2个花粉囊（图3A）。20 G y处理花芽分化进度迟缓，6个雄蕊的花药四角开始突起（图3C），未分化为花粉囊，推断该处理的花芽分化停止在雄蕊分化期。和CK相比，30 Gy处理雄蕊缺少一个，分化停滞在肾形阶段，花瓣数目为5个，雌蕊畸形未形成三棱形（图3D）。

2.2.2 辐射对‘杨范内斯’花芽分化的影响 8月1日对‘杨范内斯’鳞茎进行切片拍照观察，发现此时CK已经完成整个花芽分化进程（图4A，图4B），和‘红牌’CK的形态相似。

图2 不同辐射剂量对郁金香鳞茎中心芽长的影响Figure 2 Effect of different radiation dose on length of central bud of ‘Red Label’

由图4可以看出，5 Gy处理的鳞茎花芽分化整个阶段已经完成，出现花药个别花粉囊缺失（图4C），柱头四棱柱等现象（图4D）。10 Gy处理的鳞茎柱头呈现不规则形状，雄蕊畸形，花粉囊缺失较多（图4E）。20 Gy处理的鳞茎花芽分化进度迟缓，雄蕊与雌蕊未完全分开，6个雄蕊呈现椭圆形或者肾形，未形成 4个花粉囊，花瓣呈短粗状停滞分化。推断20 Gy处理的花芽形态分化停滞在花瓣分化期（图4F）。30 Gy处理的鳞茎花芽分化严重迟缓，花瓣形态短粗、结构不完整，雄蕊呈现肾形、未形成4个花粉囊（图4G），从纵切面可以看到生长锥的基部周围有几个雄蕊原基小突起（图4H）。推断30 Gy处理的鳞茎花芽形态分化在花瓣分化期已经停滞。

图3 辐射对‘红牌’花芽分化的影响Figure 3 Effect of radiation on flower bud differentiation of ‘Red Label’

图4 辐射对‘杨范内斯’花芽分化的影响Figure 4 Effect of different radiation dose on flower bud differentiation of ‘Jan van nes’

2.3 辐射对郁金香鳞茎出苗率的影响

由表1表明，随着辐射剂量的增大，3个品种的出苗率均呈现逐渐降低的趋势，辐射剂量越高，死亡率越高。不同品种对辐射的敏感度不同，其中，‘白雪公主’对铯-137γ射线的辐射较敏感，辐射剂量为10 Gy时，出苗率只有2.67%；‘红牌’耐辐射的能力最强，5 Gy处理出苗率仍高达91.45%。

表1 辐射对不同郁金香品种出苗率的影响Table 1 Effect of different radiation dose on the emergence rate of different cultivars of tulip

3个品种鳞茎经5 Gy辐射处理后的出苗率均在60%以上，而10 Gy处理的出苗率均降至30%以下。说明，对3个品种花芽分化期的鳞茎进行辐射诱导，半致死剂量在5～10 Gy之间。

2.4 辐射对郁金香蕾期的影响

‘红牌’鳞茎5 Gy辐射处理，蕾期花瓣边缘出现明显裂刻，叶片边缘开裂（图5A）；10 Gy处理，蕾期植株矮小、叶片开裂、花葶不抽出（图5B）。‘杨范内斯’鳞茎10 Gy处理，蕾期植株矮缩，花葶不抽出，叶片变窄、细长或畸形（图5C）；10 Gy处理，蕾期植株矮小、叶片变窄、花瓣和花丝缺失、柱头畸形（图5D）。

2.5 辐射对郁金香开花性状的影响

‘红牌’鳞茎经5 Gy处理的开花率达到80%，已开花植株花瓣全部出现不同程度的裂刻；经10 Gy处理的花瓣裂刻加深，花瓣颜色不均匀（图6）。由图7可以看出，和CK（I）相比，‘白雪公主’鳞茎经5 Gy辐射之后的开花性状产生明显变异。主要变化为：有的植株花瓣出现红色条纹（B、C、D）、有的半个花瓣变为红色（A），雄蕊由正常的6个变为7或者更多（E、G、H），雌蕊由正常的三棱柱变为4开裂（G）、5开裂（E）或不规则畸形（F），花瓣上有残留的雄蕊（F）、花瓣边缘出现深浅不一的开裂（F、G、H）。

图5 辐射对郁金香蕾期的影响Figure 5 Effect of different radiation dose on flower bud stage of‘Red Label’ and ‘Jan van nes’

图6 辐射对‘红牌’开花性状的影响Figure 6 Effect of different radiation dose on flowering traits of ‘Red Label’

图7 5 Gy辐射对‘白雪公主’开花性状的影响Figure 7 Effect of 5 Gy radiation on flowering traits of ‘Royal virgin’

3 结论

本研究对不同辐射剂量处理郁金香鳞茎进行切片，观察辐射对其花芽分化形态的影响，并进行田间栽培，在苗期、蕾期、花期进行了形态学观察。不同剂量的辐射处理对郁金香不同时期的影响程度也不相同，发生显著性变异的较多。试验结果表明，大于5 Gy辐射处理能显著抑制鳞茎中心芽的生长，且辐射剂量越大，抑制作用越明显。储藏期间对中心芽体进行切片观察发现，辐射剂量越大，花芽分化受到的影响越大、分化进度越慢。和CK相比，5 Gy处理的鳞茎已完成花芽分化且花结构基本完整，10～30 Gy辐射处理的出现了花芽分化停滞、花瓣短粗或停滞分化、雄蕊为分化早期的肾形、花药四角刚开始凸起、花粉囊缺失、柱头呈现四棱形或者畸形等不同突变状态。

在辐射育种中选择适宜剂量和剂量率是提高诱变效率的重要因素[23]。由本试验苗期观察发现，‘白雪公主’对铯-137γ射线的辐射较敏感，而‘红牌’耐辐射的能力相对较强。随着0～30 Gy辐射剂量的增大，不同品种均呈现辐射剂量越高，死亡率越高，出苗率越低。20 Gy和30 Gy处理的出苗率为0%。3个品种50%的出苗率均发生在处理5～10 Gy之间，由此可初步推断花芽分化期郁金香的辐射半致死剂量在5～10 Gy。由蕾期和花期的调查结果表明，辐射剂量越大变异效应越显著，其主要变异有植株矮小、长势缓慢、叶片开裂或畸形、花瓣变异或缺失、花葶不抽出、雌蕊和雄蕊缺失增多或畸形等。5 Gy处理的花瓣边缘出现不同程度的裂刻，是筛选变异品种的合适剂量。

4 讨论

张继娜[24]和汪晓谦[25]将郁金香的花芽分化分为未分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期，其中，在雌蕊分化期可明显看到在花芽原基的顶端形成三棱形的雌蕊[26]，据此推断出本研究中CK和5 Gy处理的鳞茎已完成花芽分化的整个阶段，而10～30 Gy处理的鳞茎花芽分化进度缓慢甚至停滞。

辐射诱变育种是利用γ射线等诱发植物基因和染色体畸变，获得有价值的突变体，从而育成优良品种[27]。本研究中，5 Gy处理的鳞茎出苗率在50%以上，能够完成花芽分化进程，且开花性状产生了一些变异，比如花瓣边缘出现裂刻、花色变异等，说明5 Gy处理有利于得到更多的花部变异，是筛选变异品种的合适剂量。前人对百合L.brownievar.viridulum鳞茎进行辐射，从不定芽植株的突变率考虑，辐射诱发变异的适合剂量是1～3 Gy[28]。该剂量和本研究结果比较接近，百合和与郁金香同属一科，可见他们对辐射剂量的敏感度也比较接近。

辐射诱变育种中常用的γ射线辐射源是钴-60、铯-137及核反应推[23]。花卉研究中利用钴-60γ射线的较多，而选用铯-137γ射线的极少。本文研究结果表明铯-137γ射线同样可以达到辐射变异效果。需要注意的事项是，植物组织器官发育阶段和生理状态不同，对辐射的敏感性存在很大的差异[23]，因此，本文选择花芽分化前且周径大于10 cm的鳞茎进行辐射，这样可以保证当年观测到花部的辐射效果。