止麻消痰活血汤治疗大鼠无复流心肌梗死实验研究

刘 琪，宋温婷,贾运时，李武卫

(石家庄市中医院心病二科，河北 石家庄 050000)

随着我国社会老龄化程度加重、居民生活水平的提高及日常饮食习惯的改变，急性心肌梗死(Acute myocardial infarction，AMI)的发病率呈逐年增加的趋势，且具有较高的病死率[1-2]。临床上对AMI的治疗以疏通闭塞的冠状动脉为目的，抗血栓、抗缺血治疗及手术介入治疗，使得AMI的病死率大大下降，但在AMI冠脉再通后，心肌组织仍会出现低灌注或无灌注的状态，称之为无复流(No-reflow,NR)现象[3-4]。NR会增加AMI患者围手术期的病死率，影响患者恢复期的心室重塑，增加心血管不良事件的风险[5]。本研究通过对心肌梗死NR大鼠给予止麻消痰活血汤干预治疗，研究其对于NR的治疗效果，探讨其改善NR的作用机制，在发挥中医药优势的基础上，为NR的防治寻找新的治疗方向。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料:选用2个月龄雄性健康大鼠60只，动物批准号：SCXK(京)2018-0007。均购于北京华阜康生物科技股份有限公司，饲养于清洁级实验室中在(22±2)°C室温下，保持敷料干燥，自由摄食饮水摄食，适应性喂养1周后开始实验。NF-κB p65及phospho-NF-κB p65抗体均购于北京奥维亚生物技术有限公司、IL-6、CRP及TNF-α剂盒试剂盒均由北京美迪科生物技术有限公司提供，Western blot及凝胶电泳试剂均购于南京凯基生物有限公司。

1.1.2 仪器：台式离心机(型号：5424r，美国Eppendorf公司)、切片机(型号：OPJ-1B，厂家：天津天利航空机电有限公司)、全自动酶标仪(型号：Read Max 1900Plus，上海闪谱生物科技有限公司)、显微镜(型号：Olympus IX71，日本OLYMPUS)、PCR 仪(型号：Step One Plus Real-Time,美国Applied Biosystems公司)、电泳仪(型号：Bio-RaD，美国Bio-Rad公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、模型制备及干预：将60只大鼠随机分为对照组、模型组和止麻消痰活血汤组，各20只。将大鼠采取俯卧位进行固定，按照1.5 ml/kg标准，进行3%戊巴比妥钠注射麻醉，然后将其进行仰卧位固定，胸骨左缘2～4肋间，行横切口(约1.5 cm)，充分暴露心包，对冠状动脉左前降支采用缝合线进行结扎，结扎90 min后，松解结扎线，然后缝合切口，而对照组只穿线，不结扎，正常缝合切口即可。造模成功后，所有组大鼠禁食但不禁水12 h后，止麻消痰活血汤组给予200 μg /(kg·d)剂量的止麻消痰活血汤灌胃，止麻消痰活血汤方组成：黄芪、鸡血藤各20 g，当归、川芎、赤芍、桃仁、红花、陈皮、半夏、乌梢蛇各10 g，丹参、胆南星各12 g，全蝎6 g，桑枝15 g。止麻消痰活血汤方中的所有药物来源及制备均来自石家庄市中医院中药房。对照组和模型组给予等量的生理盐水灌胃，均连续4周。

1.2.2 心肌组织形态学情况观察：实验4周后，采用4 mg/kg的10%的水合氯醛对大鼠进行腹腔注射麻醉处理，取心肌组织作为标本，切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小标本两块，0.3%戊二醛和1%的四氧化锇进行固定，梯度丙酮脱水进行石蜡包埋，切片机切成厚度5 μm的切片，进行HE染色，镜下观察染色情况及组织轮廓。

1.2.3 超声心动图检测：实验4周后，采用4 mg/kg的10%的水合氯醛对大鼠进行腹腔注射麻醉处理，大鼠胸部皮毛处理采用8%的Na2S进行处理。采用超声心动图仪(17.5 MHz探头；Visual Sonics Vevo770)对左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室射血分数(LVEF)、左心室收缩末期内径(LVESd)以及左心室舒张末期内径(LVEDd)水平进行测定。

1.2.4 IL-6、CRP、TNF-α检测：实验成功4周后，各组大鼠4%水合氯醛进行麻醉，心脏穿刺取血，离心机(3000 r/min)离心10 min，取上清，-20 ℃备存。采用ELISA法对IL-6、CRP及TNF-α水平进行测定，按照相关试剂盒说明书进行操作，波长450 nm下酶标仪读取OD值，计算出IL-6、CRP及TNF-α的浓度。

1.2.5 Western blotting测NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白表达：采用Western blot法检测心肌组织NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白的表达：采用改良异硫氰酸胍法提取总蛋白，-80 ℃下冻存，将总蛋白溶入等体积的缓冲液中煮沸10 min，经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离蛋白，然后转印到PVDF膜上，置入封闭液中摇动1 h,加入一抗(NF-κB p65及phospho-NF-κB p65均为1∶500稀释)孵育，4 ℃下过夜。二抗孵育(1∶2000稀释)2 h，免疫荧光增强法显色，NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白的表达量与β-actin的灰度比值表示。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计学软件，计量资料以均数±标准差表示，不同组间比较采用F检验，P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 三组大鼠心肌组织形态学情况 实验4周后，对照组大鼠心肌细胞完整、排列均匀，形态正常；模型组大鼠心肌组织排列紊乱、心肌细胞间隙增宽，大量纤维组织生成；止麻消痰活血汤组心肌组织排列较为有序，纤维组织较少(图1)。

2.2 三组大鼠心功能情况比较 见表1。实验4周后，与对照组大鼠相比，模型组和止麻消痰活血汤组，LVESd及LVEDd明显增加，LVEF及LVFS明显降低，且模型组比对照组更明显(P<0.05)。

表1 三组大鼠心功能情况比较

2.3 三组大鼠血清炎症因子水平情况比较 见表2。实验4周后，模型组和止麻消痰活血汤组IL-6、CRP、TNF-α水平高于对照组，且模型组高于止麻消痰活血汤组(P<0.05)。

表2 三组大鼠血清炎症因子水平情况比较

2.4 三组大鼠心肌组织NF-κB p65蛋白及其磷酸化水平表达情况比较 见表3(图2)。实验4周后，三组大鼠心肌组织NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白水平表达情况：对照组<止麻消痰活血汤组<模型组(P<0.05)。

表3 三组大鼠心肌组织相关蛋白表达情况比较

A:对照组；B:模型组；C:止麻消痰活血汤组

1～2为对照组，3～4为模型组，5～6为止麻消痰活血汤组

3 讨 论

AMI的发病因素较复杂，主要由冠状动脉粥样硬化引起，导致心脏供血不足或中断，从而对心肌组织产生损伤[6]。目前临床上对AMI的治疗以疏通闭塞的冠状动脉为目的，抗血栓(抗凝、抗血小板药物)、抗缺血治疗(β受体阻滞剂、抗心肌缺血药物、钙离子阻滞剂)及手术介入治疗，其中经皮冠状动脉介入治疗(PCI)是治疗AMI的主要手段，其血管再通率较高。但PCI术后，患者仍会存在心肌再灌注不完全的现象，即NR[7-8]。NR的发生机制目前尚未完全明确，通常认为AMI患者在经过治疗后，血小板栓子、血脉粥样硬化碎片及血凝块随着恢复正常的血流进入循环系统，会导致微栓塞，从而引发NR[9-10]。临床上西医对NR常采用血管扩张剂、抗血栓及他汀类药物进行防治，但其给药剂量较大，且部分药物价格昂贵，术中术后对患者血压心率等影响较大，有一定的副作用，易导致心血管不良事件的发生，且不能完全阻止NR现象[11]。因此寻找安全有效、便捷且价廉的中医药治疗手段十分重要。

相关研究证实，发生NR时，机体的微循环水平血流仍未完全恢复，一定程度增加心肌的僵硬程度，引发心脏重塑，表现为进行性左心室腔扩大，心功能异常[12-13]。中医理论认为，瘀血阻络、心络受阻、瘀血内阻等为NR的病机特点，因此活血化瘀通络为治疗NR的主要原则[14]。止麻消痰活血汤是由邢月朋名老中医所创的经验方，药方中的黄芪具有清热燥湿、泻火解毒功效；当归、川芎、赤芍、丹参及鸡血藤具有活血祛瘀、补血活血的功效；桃仁可活血祛痰，半夏、陈皮及胆南星具有清热化痰，理气健脾的功效；全蝎、乌梢蛇具有祛湿通络，止痉止痛的功效；红花可起到活血通经、散瘀止痛的作用；桑枝可生津利水、祛湿通络、祛风养血，诸药共用可达到活血通脉、益气化浊的功效。 本研究结果显示，止麻消痰活血汤组大鼠心肌纤维化减轻，LVESd及LVEDd比模型组明显降低，LVEF及LVFS明显增加，这说明了止麻消痰活血汤可有效缓解心肌纤维化的发生，改善心肌纤维化；改善心肌能量组织代谢，促增加冠脉的灌注量，减轻左心室负荷，减少心肌耗氧量和做功量，从而改善左心室功能。

缺血再灌注可导致机体产生大量氧自由基生成，心肌产生氧化应激损伤，大量中性粒细胞在心肌内黏附和浸润，引发炎症反应，使毛细血管通透性增加，微循环阻塞，促成NR发生[15-16]。CRP是临床常用的反应炎症反应水平的指标[17]。TNF-α是炎症的启动因子，在炎症的发生及发展过程中起到核心作用[18]。IL-6是一种炎症反应因子，在机体免疫应答中起到多样性作用。以上诸炎症因子与心肌缺血及再灌注有着密切的关系，可介导微循环和内皮细胞的损伤，导致NR的发生。现代药理学认为，鸡血藤具有一定的抗炎作用，桃仁有具有抗炎抗菌的功效。本研究结果显示，实验4周后，模型组IL-6、CRP、TNF-α水平高于止麻消痰活血汤组，本研究表明止麻消痰活血汤具有抑制炎症因子的合成和分泌，可调控机体炎症反应，改善心肌供血障碍，改善心肌再灌注损伤，对心肌组织起到保护作用。

NF-κB是一种存在于体细胞中的核转录因子，可与多种基因上游的启动子结合，促进转录翻译的发生，对机体炎症、细胞生长及免疫应答起到重要作用。NF-κB是由p50和p65亚基形成的异源二聚体，机体发生缺血性损伤时，在级联放大反应的作用下被激活，并对炎症反应起到促进和加剧的作用。本研究结果显示，实验4周后，止麻消痰活血汤组大鼠心肌组织NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白表达水平明显低于模型组。这是因为通过止麻消痰活血汤治疗，可下调NF-κB p65及phospho-NF-κB p65蛋白的表达，对心肌组织细胞核内外活化的NF-κB起到灭杀作用，从而终止炎症介质转录，限制炎症反应，改善心肌组织再灌注后NR的现象。

综上所述，止麻消痰活血汤可通过调控NF-κB p65蛋白及其磷酸化水平，进而调控炎性因子水平，改善NR现象，并可抑制心脏重塑，改善心功能，具有一定的临床参考价值。