基于分光光度法的137份山黧豆种质资源ODAP含量分析

郝晓鹏，王 燕，董 雪，田 翔，赵建栋，畅建武

（山西农业大学农业基因资源研究中心（山西省农业科学院农作物品种资源研究所），农业部黄土高原作物基因资源与种质创制重点实验室，杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室，中国农业科学院杂粮研究中心（太原），山西太原 030031）

山黧豆（Lathyrus sativus L.）又称家山黧豆、草香豌豆、牙豆，是豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papilionoideae）山黧豆属（Lathyrus L.）的唯一栽培种，为一种起源于西亚和中东地区的古老作物[1-2]。山黧豆在我国主要种植在甘肃、宁夏、内蒙古、陕西和山西。山黧豆可以食用种子、芽菜，植株可作牧草，因其具有耐旱、耐瘠薄、耐涝、耐盐碱和抗病虫的特点，是世界贫穷地区和农业环境恶劣地区的首选作物[3]。尽管山黧豆有上述诸多优点，但由于山黧豆毒素（β-L-oxalyl-2，3-diaminopropionic acid，β-ODAP）大量存在于其种子、幼苗和植株的根、茎、叶等各组织和各生育期，而长期食用会导致人和牲畜等神经系统的损伤[4]。因此，该毒素是山黧豆农业生产应用的主要限制因素，已成为山黧豆种质资源开发和应用的瓶颈[5-7]。迄今为止，仅鉴定出一些低毒资源[8]，尚未发现山黧豆无毒品种。

山黧豆毒素，即三七素（Dencichine），易溶于水，呈酸性，为一种非蛋白质氨基酸，分子式C5H8N2O5，分子质量176.13 g/mol。目前发现存在于山黧豆（Lathyrus sativus）、猪屎豆（Crotalaria mucronata）、金合欢（Acacia farnesiana）、三七（Panax notoginseng）、人参（Panax ginseng）和苏铁（Cycas revoluta）等植物当中，并作为止血、活血药物的重要功能成分[9]。山黧豆毒素不仅具有药用功效，而且在植物抗逆性、化感作用、抑制真菌和昆虫拒食等方面有重要作用[10]。

研究表明，该毒素还存在一个同分异构体（α-L-oxalyl-2，3-diaminopropionic acid，α-ODAP），毒理学研究得出该异构体没有神经毒性，而β-ODAP在水溶液、高温条件或者酸碱性条件下可以向α-ODAP 异构体转变[11-12]。

本研究采用Emmrich 改进后的Rao 分光光度法[13-14]，对137 份山黧豆种质资源ODAP 含量鉴定，以期筛选出高毒、低毒资源，可为山黧豆无毒、低毒品种筛选和利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 选择来源于印度、叙利亚、埃塞俄比亚、西班牙、孟加拉国、俄罗斯等国家的137 份山黧豆种质资源，现保存于山西农业大学农业基因资源研究中心种质资源库。

1.1.2 仪器设备 Synergy H1 全功能微孔板检测仪（美国BioTek），5804R 高速离心机（德国Eppendorf），HH-600 型水浴锅（江苏金分仪器有限责任公司），Dragon lab MX-S 漩涡仪（大龙兴创实验仪器股份公司），Tissue lyser Ⅱ高通量研磨仪（德国QIAGEN），Direct-Q3 超纯水仪（美国Millipore）。

1.1.3 试验试剂 无水乙醇分析纯（≥99.7%，天津市开通化学试剂有限公司），KOH 分析纯（≥85.0%，天津市恒兴化学试剂制造有限公司），邻苯二甲醛生化试剂（≥99.0%，生工生物工程（上海）股份有限公司），四水合四硼酸钾生化试剂（≥98.0%，生工生物工程（上海）股份有限公司）、β-巯基乙醇生物试剂（≥99.0%，生工生物工程（上海）股份有限公司）、超纯水（自制）、三七素标样（≥98.0%，上海纯优生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 样品制备 2018 年7 月，将137 份山黧豆种质资源播种于山西省农业科学院大吴创新基地智能温室中。采用育苗盘进行播种，每穴播种3 粒，每份材料2 个重复。播种后10 d，取叶片放入预先填充变色硅胶的10 mL 离心管当中，4 ℃冰箱中干燥10 d，使叶片完全脱水。分别称取10 mg 干燥叶片放入含有钢珠的2 mL 离心管，采用高通量研磨机粉碎成粉末状。

1.2.2 缓冲液配制（1）称取邻苯二甲醛41 mg，溶解于1 mL 乙醇中，加入82 μL β-巯基乙醇，配制成A 液。（2）称取6.25 g 四水合四硼酸钾，在60 ℃水浴下溶解并冷却至室温，配制成B 液。将A 液与B 液混合，定容于50 mL 容量瓶中，配制成OPA-Tetraborate buffer。

1.2.3 回归曲线建立方法 称取0.6 mg 三七素标准样于2 mL 离心管当中，用1 mL 超纯水60 ℃加热溶解，制备成三七素母液。而后将0.6 mg/mL 母液依次稀释为0.3、0.15、0.075、0.037 5、0.018 75、0.009 375 mg/mL 共7 个梯度，每个浓度设置4 个重复。每个样品检测4 次，取平均值，并基于不同浓度和吸光度值建立回归方程。

1.2.4 ODAP 毒素检测 将10 mg 叶片研磨后的粉末加入1.5 mL 蒸馏水旋涡仪混匀，放入95 ℃水浴锅当中20 min，提取ODAP 毒素。采用Emmrich 等改进后的Rao 分光光度法，使用BioTek Synergy H1全功能微孔板检测仪在420 nm 波长进行吸光度（OD）检测，每个样品检测4 次，取平均值。

其中，y 为提取液当中ODAP 浓度（mg/mL），z 为干燥叶片ODAP 百分含量。

2 结果与分析

2.1 回归方程的建立

由表1 可知，随着标准样质量浓度由大到小成比例降低（0.6～0.009 375 mg/mL），各浓度吸光度值呈现成比例的递减（1.891～0.018）。而变异系数则是由高浓度向低浓度逐渐增大，这是由于随着质量浓度的降低，仪器本身的系统误差造成的。

表1 7 个浓度下4 个平行各吸光度值统计

由图1 可知，采用一元线性回归模型，最终建立回归方程y＝0.314 6x＋0.006 7（R2＝0.999 8），其中，x 为水解反应液与对照的吸光度值之差，y 为提取液浓度。

2.2 ODAP 在山黧豆资源中含量分异

在建立回归方程的基础上，对137 份山黧豆种质资源苗期10 d 叶片进行取样。

由图2 可知，137 份山黧豆叶片当中ODAP 含量平均值为3.552%，最大值为7.307%，最小值为1.065%，标准差为1.115，通过K-S 检验，P 值为0.839（P≥0.05），即137 份山黧豆种质资源叶片ODAP 含量符合正态分布。

2.3 山黧豆资源ODAP 含量等级划分

对137 份山黧豆叶片ODAP 含量进行方差和标准差计算，采用以1δ 为间距（δ 为ODAP 含量标准差，X 为含量平均值），划分为5 级，其中，1 级＜X-1.5δ，5 级≥X＋1.5δ，每一级相差1δ，ODAP 含量划分等级如表2 所示。

表2 137 份山黧豆ODAP 含量等级统计

由表2 可知，在137 份山黧豆资源中，ODAP中等级资源有63 份，平均值为3.477%。中低等级和中高等级资源均为29 份，平均值为2.532%和4.566%。低等级和高等级资源均为8 份，平均值分别为1.478%和6.239%。

从变异系数来看，中高等级资源变异系数最低，为0.063，低等级资源变异系数最高，为0.191。

3 结论与讨论

有关山黧豆毒素定量检测方法的研究较多，有Rao 分光光度法[15]、荧光光度法[16]、高效液相色谱法[17-20]、毛细管电泳法[21]和气相色谱质谱分析法[22]等。分光光度法和荧光光度法检测准确、操作简单、快速，但无法区分2 个异构体，高效液相色谱法检测准确度较高，但操作繁琐，仅适合少批量精确鉴定，而毛细管电泳法和气相色谱质谱分析法则应用较少。

分光光度法和高效液相色谱法均是氨基酸及其类似物常用的检测方法之一[23-24]。其在山黧豆ODAP 检测中应用较为普遍，其中，分光光度法主要利用ODAP 水解产物α，β-二氨基丙酸（α，β-diaminopropionic acid，DAP）与邻苯二甲醛（O-phthal aldehyde，OPA）及巯基乙醇（β-Mercaptoethanol，β-Me）反应形成咪唑-异吲哚的黄色产物，在420 nm条件下有高的吸收峰[9，14，25]。本研究采用Emmrich 改进后的分光光度法较李志孝等[16]荧光光度法和高效液相色谱法[18]减少了样品前处理繁琐的技术流程，节省了检测分析时间，相比较液相色谱方法更加快速、高效。

本研究通过采用Rao 改进后的分光光度法建立了山黧豆ODAP 含量和吸光度的回归方程，实现了ODAP 含量的快速、准确、高效的检测。通过频度分布检验，确定毒素含量在137 份山黧豆中呈正态分布，将137 份山黧豆资源ODAP 含量划分为5 级并筛选到高毒和低毒山黧豆资源各8 份。