噬菌体鸡尾酒制剂对牛奶中产志贺毒素大肠杆菌O157:H7的抑制作用

季慕寅， 李 敏， 张海燕， 张 爽， 马 勋， 张 炜*

(1.南京农业大学 动物医学院，江苏 南京 210095； 2.芜湖职业技术学院，安徽 芜湖 241003；3.石河子大学 动物科技学院，新疆 石河子 832003)

产志贺毒素大肠杆菌O157:H7分离于1982年，现已成为一种重要的食物和水传播病原体，可引起人类腹泻、出血性结肠炎和溶血性尿毒症综合征(HUS)。大肠杆菌O157:H7是一种肠出血性菌株，可感染消化道，引起出血性腹泻引起腹部绞痛。大肠杆菌O157:H7可通过食用受污染的牛奶和食物后，经粪口途径传播。肠出血性大肠杆菌O157:H7会诱发因产生志贺毒素而引发的疾病，导致一系列胃肠道疾病，从水样腹泻到出血性结肠炎。流行病学调查在追踪家养动物，特别是圈养牛的志贺毒素肠出血性腹泻暴发后，已确定牛是大肠杆菌O157:H7的主要宿主。农场上的反刍动物是大肠杆菌O157:H7的天然宿主。人兽共患病大肠杆菌O157:H7的传播发生在食用未经巴氏消毒的乳制品或未煮熟的肉类，或接触含有志贺毒素肠出血性大肠杆菌的污染物之后。大肠杆菌O157具有比共生大肠杆菌菌株更顽强的生存特性，使这种食源性病原体能够在人类食物链中经常遇到的各种恶劣条件下生存。因此，对于食源性病原菌的控制除传统的巴氏消毒和使用抗生素之外，必须开发绿色安全的替代品，其中之一就是噬菌体。

噬菌体是能够感染细菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称。噬菌体在自然界分布广泛且含量高。噬菌体分为烈性噬菌体和温和性噬菌体，其中烈性噬菌体因其安全性被重视。最近的研究已经证明了噬菌体在控制食品和动物生产中的人畜共患病原体方面的有效性和安全性，噬菌体可作为食品生产和生物防治食源性疾病中较好的选择。噬菌体作为一种生物抗菌剂具有特异性强、抗细菌耐药性和开发时间短等优点。目前已有噬菌体用于食品生物防控的报道，如Listex_P100已经作为世界上第一个通过美国食品药品管理局(FDA)认证的噬菌体食品添加剂，用于抑制食品中的李斯特菌。

本研究以产志贺毒素大肠杆菌O157:H7(ATCC 43895)为宿主菌从污水中分离纯化得到3株噬菌体，通过实验研究其宿主谱，并评估易被O157:H7大肠杆菌污染的食品中利用噬菌体控制O157:H7大肠杆菌的潜力和功效，为制备噬菌体抗菌剂抑制产志贺毒素大肠杆菌O157:H7污染提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 供试材料

ABI 7500实时荧光定量仪(美国Applied Biosystems 公司)；电热恒温培养箱(美国Thermo公司)；Allgegra X-15R低温冷冻离心机(美国Beckman Coulter 公司)；台式离心机(德国Eppendorf公司)；Mastercycler ep gradient PCR仪(德国Eppendorf 公司)；Milli-Q Synthesis超纯水机 (德国millipore 公司)；Sub cell GT核酸电泳仪(加拿大Bio-Rad公司)；NanoDrop 2000细菌基因组DNA浓度检测仪 (美国Fisher 公司)等。

O157:H7大肠杆菌ATCC 43895、ATCC 43889和NCTC 12900为标准菌株。O157:H7-EC204和EC1251为实验室保存菌种。污水样品来自于南京市某污水处理厂。

Luria-Bertani(LB)琼脂培养基；琼脂(青岛高科园海博生物技术有限公司)；SM液：0.22 μm微孔滤膜德国Millipore公司；双层琼脂培养基：下层培养基为固体LB培养基、上层培养基为半固体LB培养基和0.5%琼脂粉。

1.2 实验方法

1.2.1 宿主菌株的复苏与培养 从冻存液中接一环菌液，划线于LB固体平板，置于37 ℃ CO培养箱中培养过夜。次日挑取O157:H7大肠杆菌ATCC 43895单菌落接种于5 mL新鲜的LB液体培养基中，置于160 r/min、37 ℃摇床中，振荡培养8 h。然后将培养液10倍梯度稀释，用涂平板法进行计数，保存备用。

1.2.2 噬菌体的分离纯化及效价测定 参照Adams的方法，使用双层平板法进行噬菌体的分离和纯化。将来自江苏省南京市某污水处理厂的污水静置2 h，使用滤纸过滤后，5 000 r/min、4 ℃离心5 min，取上清并用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。从中吸取500 μL滤液与2.5 mL处于对数期的大肠杆菌ATCC 43895及5 mL LB培养基过夜培养。混合培养液经8 000 r/min、4 ℃离心10 min，上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤后，即得到噬菌体原液。噬菌体原液倍比稀释后，采用双层平板的方法进行噬菌体的纯化，具体操作如下：取100 μL合适梯度噬菌体液、100 μL宿主菌和4 mL融化后冷却至50 ℃的半固体培养基混合，倒于LB下层固体平板上，待凝固后于37 ℃培养箱培养约8 h，使用10 μL枪头挑取大小一致的透亮的噬菌斑于1 mL SM液中，加入100 μL生长至对数期的宿主菌，37 ℃条件下培养约12 h，8 000 r/min、4 ℃离心10 min，得上清液。经反复纯化3～5次直至噬菌斑大小基本一致即得到纯化的噬菌体。噬菌体效价的测定：将纯化后的噬菌体原液进行10倍倍比稀释，取100 μL稀释液与100 μL宿主菌混合，加入4 mL 50 ℃的半固体培养基，倒双层平板，37 ℃培养8 h，重复3次。

1.2.3 噬菌体宿主谱测定 采用点滴法进行宿主谱的测定。首先取100 μL对数期的宿主菌加入到50 ℃的半固体LB培养基中，混匀后倒入预先制备好的LB固体平板上，待上层半固体凝固后，取5 μL效价为10PFU/mL的噬菌体滴在上层平板表面，待噬菌体液滴干燥后，置于37 ℃培养箱培养8 h，观察裂解情况并记录。

1.2.4 噬菌体在牛奶中的应用 参照Huang等报道的的方法并进行改进，首先按1∶1∶1混合3种噬菌体，制成噬菌体鸡尾酒制剂。在接种10 μL(10CFU/mL)O157:H7大肠杆菌ATCC 43895的新鲜牛奶中加入100 μL(总效价为10CFU/mL)的相应噬菌体鸡尾酒制剂(MOI=10)，在对照组牛奶中加入等体积的PBS，将样品在4 ℃或25 ℃温育。在温育0、1、3、6、9 和12 h后，取出等量样品通过平板稀释法进行活菌计数(CFU/mL)。实验重复2 次，每次设2个生物学重复。运用Graphpad Prism 5软件进行分析和绘图，实验数据采用ANOVA进行邓肯氏差异分析方法分析(

P

<0.05，差异显著)。

2 结果与分析

2.1 噬菌体的分离纯化及效价测定

通过双层平板法经过5次纯化后，3株噬菌体所形成的噬菌斑形态和大小保持均匀一致，呈圆形透明状态，直径均约为(0.5±0.2) mm(图1)，其原液效价高达10PFU/mL。

图1 3株噬菌体的噬菌斑

2.2 噬菌体宿主谱测定

采用点样法测定噬菌体的宿主范围，由表1可见，噬菌体可以裂解多种产志贺毒素大肠杆菌O157:H7菌株。说明噬菌体宿主谱较为广泛。

表1 3株噬菌体的宿主范围

2.3 噬菌体在牛奶中的抑菌效果检测

由图2可知，25 ℃时对照组从初始菌量5.04 (lg(CFU/mL))，经过10 h增加到8.28 (lg(CFU/mL))，而实验组在按照MOI=10加入噬菌体的情况下，菌量从2 h开始显著降低，至最终10 h，相比于对照组MOI=10时下降4.30 (lg(CFU/mL))(

P

<0.001)，抑菌效果非常明显。

图2 噬菌体在牛奶中的抑菌效果(MOI=10)

3 结论与讨论

肠出血性大肠杆菌O157:H7是世界范围内引起人类严重疾病的主要食源性病原体。疾病控制和预防中心(CDC)估计，大肠杆菌O157:H7感染每年在美国造成73 000人患病，2 200人住院，60人死亡。CDC的疫情监测数据显示，大肠杆菌O157:H7的感染在1999年达到高峰后开始下降。然而，大规模疫情和零星病例继续发生，需要重点关注。对14个世界卫生组织次区域中10个的数据库和研究的审查表明，全球大肠杆菌的发病率为每年280万例。在过去的二十年中，大肠杆菌O157:H7诱导的溶血性尿毒综合征已成为儿童急性肾功能衰竭的重要病因。然而，对于O157:H7大肠杆菌感染并没有特定的治疗方法，使用抗生素可能是禁忌。因此，治疗主要是支持性的，以限制症状持续时间和预防全身并发症。鉴于这种情况，采用新的生态友好型策略，如噬菌体，用作抗O157:H7大肠杆菌感染的生物防治剂随即被重视。近年来，噬菌体由于具有绿色安全，广泛分布性，具有靶标特异性以及研究成本低等优势而重新受到关注。

本研究从污水中分离出3株可裂解肠出血性大肠杆菌O157:H7的烈性噬菌体。宿主谱分析表明这三株噬菌体的宿主谱不同。但这3株噬菌体的鸡尾酒制剂可覆盖本研究的5株肠出血性大肠杆菌O157:H7，具有应用于防控大肠杆菌O157:H7的潜力。对噬菌体混合制剂的进一步抑菌试验表明，在25 ℃时，对照组从初始菌量5.04 (lg(CFU/mL))，经过10 h增加到8.28 (lg(CFU/mL))，而实验组在MOI=10加入噬菌体的情况下，菌量从2 h开始显著降低，至最终10 h，相比于对照组MOI=10时下降4.30(lg(CFU/mL))，抑菌效果非常明显。Bao等在25 ℃时将噬菌vB_SenMPA13076按照MOI=10 000加入沙门氏菌污染的牛奶中时，作用5 h后菌量降低了约2个数量级。聂若男等在25 ℃时将噬菌体T139应用于牛奶中时，噬菌体以MOI=10或MOI=100加入时，沙门氏菌菌量从6 h开始显著降低，至最终12 h，沙门氏菌菌量分别下降了4.32 (lg(CFU/mL))和4.27 (lg(CFU/mL))，这与本研究的效果相当。

综上所述，本研究为达到更好的抑菌效果，在未来的研究中会不断改善噬菌体鸡尾酒制剂中噬菌体的种类和配比，以加强抑菌效果。同时适当延长噬菌体的作用时间，以研究噬菌体作为抗菌剂的保质期。该噬菌体鸡尾酒制剂作为一种新型绿色的抗菌剂，在低MOI即MOI=10时对O157:H7大肠杆菌有较好的抑制作用，因此可以用来控制牛奶中O157：H7大肠杆菌的污染，为该噬菌体鸡尾酒制剂作为抗菌剂的应用提供了实验依据。