花绒寄甲对高温胁迫的适应能力及生理响应

周友军，卢赐鼎，沈海燕，梁 运，陈祯鸿，钟景辉，谈家金，王小艺，梁光红*

（1. 福建农林大学林学院，福州 350002；2. 泉州市林业局森林有害生物防治与检疫局，泉州 362400；3. 南京林业大学林学院，南京 210037；4. 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，北京 100091）

近年来，全球异常的气候变化常导致夏季极端高温频繁出现，继而形成高温胁迫并对地球上的各种生物产生不同程度的负面影响[1-3]。显然，高温胁迫也会对昆虫的个体寿命、生长发育、种群规模、世代数量及种群的扩散与自然分布等产生影响[4-6]，因此必然会影响天敌昆虫定殖和控害潜能的发挥[7]。花绒寄甲Dastarcus helophoroides是寄生松材线虫病媒介昆虫松墨天牛Monochamus alternatus、云杉花墨天牛M. saltuarius等的重要天敌之一[8,9]，对于其他天牛类蛀干害虫也具有较强的控害作用[10-13]。花绒寄甲在林间主要以成虫自由活动，且寿命很长[14]，生活史容易受自然条件影响[15]，经常要承受高低温等诸多生态因子的胁迫和影响[16,17]，在中国东北等高纬度地区有分布，表明其对冬季严寒具有极强的适应性[9,18]，同时在我国广东等低纬度地区以成虫活动[19]，且个体发育和生殖生物学特性受到高温条件的不良影响[20]，在高温条件（26 ℃～44 ℃）下测定热休克蛋白基因，发现HSP70和sHSP基因均能响应高温胁迫并发挥重要作用[17]。

为此，以商品化花绒寄甲成虫为研究对象，通过设置不同梯度的高温胁迫条件，测定其存活能力、生殖力及生理指标，探究花绒寄甲商品化种群对高温胁迫的适应性和生理响应机制，为天敌引进后的控害效果评价及种群适生性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试虫源

花绒寄甲成虫购自国家林业局南方天敌繁育与应用工程技术研究中心。挑选同一批次健康花绒寄甲成虫置于带有马尾松树皮、松树木屑、天牛幼虫粪便等的饲养盒（13.5 cm×8.0 cm×5.0 cm）中，饲养条件；（25±1）℃、RH 75%±10%、光周期14L:10D。以大麦虫Zophobas atratus幼虫（购自广东阳江大麦虫之家）作为花绒寄甲的替代寄主。

1.2 高温胁迫试验

参照郝春凤[17]的方法，依据花绒寄甲成虫HSP基因表达量最高时对应温度为35 ℃和38 ℃，在41 ℃胁迫下出现时间效应，兼顾单一变量对研究结果的影响，在人工气候箱中（上海一恒科技仪器有限公司，Bluepard）分别设定33 ℃、36 ℃、39 ℃、42 ℃和45 ℃恒温环境，以25 ℃为对照，每组各50头同日龄花绒寄甲成虫，每日观察统计花绒寄甲成虫的死亡数量和存活时间；将花绒寄甲雌、雄成虫（1:1）放入铺有黑色卡纸的一次性培养皿中，置于上述设定的不同高温环境中观察其交配、产卵和孵化情况，统计花绒寄甲成虫的产卵量、产卵期和卵的发育历期及孵化数[21]。

1.3 高温胁迫下花绒寄甲成虫体内营养物质含量测定

依据1.2所述的研究结果，在高温胁迫中分别选择高适温区（33 ℃和39 ℃）与亚致死高温区（42 ℃）处理1 h、3 h、6 h、12 h、24 h，分别称取0.1 g花绒寄甲活虫样品，以常温（25 ℃）处理为对照。参照3,5-二硝基水杨酸法（DNS法）测定花绒寄甲总糖含量、蒽酮比色法测定海藻糖含量和异丙醇提取法测定甘油三酯含量[22,23]。所用试剂盒（WST-1法）均购自南京建成生物工程研究所（下同），按照试剂盒说明书进行操作。

1.4 高温胁迫下花绒寄甲丙二醛（MDA）含量及成虫抗氧化酶活性的测定

从1.3所述虫样中称取1 g花绒寄甲活虫样，加入少量石英砂、2 mL 10%三氯乙酸（TCA），将组织样研磨为匀浆，之后再加入8 mL的TCA继续研磨，研磨均匀后，将匀浆进行4000 r/min离心10 min；分别吸取样品（上清液）和蒸馏水（对照）2 mL，分别加入2 mL 0.6%硫代巴比妥酸溶液，搅拌均匀后在沸水上反应15 min，等待溶液冷却后再离心。取上清液分别测定532 nm波长下的吸光值。

从1.3所述虫样中分别称取0.1 g花绒寄甲活虫样品，分别采用愈伤酚木法测定POD活性、WST-8法测定SOD活性和CAT试剂盒要求测定CAT活性[24-26]，用酶标仪测定其吸光值。

1.5 数据处理方法

花绒寄甲成虫的存活时间和死亡率以及生理指标，采用单因素方差分析（one-way ANOVA，SPSS 20）与 Duncan’s新复极差法进行多重比较。采用 Origin 2018进行非线性回归拟合，根据逻辑斯蒂方程y＝(A1—A2)/[1＋(x/x0)p]＋A2，分别绘制不同温度条件（25 ℃～45 ℃）下的累计死亡率与温度的关系曲线，计算其半致死时间LT50；并进行多项式回归拟合，绘制温度与LT50变化曲线[27]。种群寿命＝（∑Ti×Ni）/∑Ni，其中 Ti为花绒寄甲死亡时间；Ni为死亡时间对应的花绒寄甲死亡数量。花绒寄甲死亡率（%）＝（花绒寄甲死亡数量/供试花绒寄甲数量）×100。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫对花绒寄甲成虫寿命的影响

与对照下的种群平均寿命（19.05 d）相比，当温度从33 ℃逐渐升高到45 ℃时，种群存活的寿命显著缩短（F4,23＝531.318，P＜0.01）（图1），其中33 ℃下的花绒寄甲成虫平均寿命最长（11.93 d），45 ℃下的花绒寄甲平均寿命最短（6.53 h），表明高温胁迫不利于花绒寄甲成虫生存，温度越高则影响越显著。

图1 不同高温胁迫下花绒寄甲种群的寿命Fig. 1 Longevity of D. helophoroides under different high-temperature stress

就成虫个体而言，与对照（30 d）相比，高温胁迫显著缩短了个体寿命（P＜0.01）。其中33 ℃下平均寿命最长（11.93 d），死亡速率最小，个体存活时间最长达20 d，此后死亡速率随温度升高逐渐增加，存活时间逐渐缩短；而45 ℃下个体寿命最短，死亡速率最大，累积全部死亡时间仅为9 h（图2）。从累积死亡率趋势可见，33～39 ℃的曲线相似且相对靠近，并具有较长的个体寿命（最长可达20 d），视为高适温区；而在42～45 ℃范围，花绒寄甲成虫存活时间很短，死亡速度极快，接近线性趋势，视为致死高温区；介于39～42 ℃则属于亚致死高温区。显然，这些结果均符合温度对昆虫生命活动影响的一般规律。无论哪一种高温胁迫，其死亡速率随胁迫时间延长都经历了慢-快-慢的过程，符合逻辑斯蒂方程曲线（表1，图3）。

图3 不同高温胁迫条件下花绒寄甲死亡曲线Fig. 3 Death curve of D. helophoroides under different high-temperature stress

表1 不同高温胁迫条件下花绒寄甲回归模型Table 1 Logistic regression model of D. helophoroides under different high-temperature stress

在高温胁迫下，花绒寄甲成虫的半致死时间（LT50）随温度（x）升高而缩短（图2）；采用前人已有模型拟合其半致死曲线变化，获得回归模型LT50＝0.628x3—73.971x2＋2856.889x—136017.377（R2＝0.971，P＝0.108）。当高温胁迫处于34.6 ℃时，其半致死时间最长，其理论LT50是12.50 d；短时间内达到半致死时间的理论致死温度为 43.9 ℃，该温度点的理论LT50是2.60 h。结合前人研究[27]及花绒寄甲在我国南方夏季高温（33～45 ℃）环境下应用实践，采用更广的高温范围获得优化的半致死曲线 LT50＝0.21093x3—19.42975x2＋502.0911x—2445.01179（R2＝0.9722，P＜0.0001）。

图2 不同高温胁迫下的半致死时间曲线Fig. 2 The semi-lethal time curve of D. helophoroides under different high-temperature stress

2.2 高温胁迫对花绒寄甲成虫生殖力的影响

2.2.1 高温胁迫对花绒寄甲成虫产卵的影响 不同高温胁迫会显著影响（F3,8＝72.56，P＜0.01）花绒寄甲成虫的产卵量和产卵期（表2）。即在33 ℃、36 ℃条件下产卵量显著低于对照，33 ℃与 36 ℃之间也存在极显著性差异（P＜0.01）；当温度高于39 ℃时，花绒寄甲成虫不产卵。同时，在33 ℃时，雌虫产卵期与对照基本一致（P＞0.05)，但当温度升高至36 ℃，产卵仅持续2.0 d；当温度继续升高（＞39 ℃）时，花绒寄甲成虫则无法产卵。

2.2.2 高温胁迫对花绒寄甲卵块发育的影响 在高温胁迫下，花绒寄甲卵块发育历期随着温度升高而缩短，其中，33 ℃、36 ℃下卵块发育历期较对照显著加快，但二者差异均不显著，表明高适温处理有利于卵的孵化；但卵的孵化率随温度升高呈显著下降趋势（F3,8＝41.36，P＜0.01），在 33 ℃和 36 ℃下卵平均孵化率较对照分别下降 32.2%和 75.4%，表明卵在高适温区随温度升高呈快速下降趋势，当温度达到39 ℃及以上时，卵块则无法孵化（表2）。

表2 高温胁迫条件下花绒寄甲卵块发育情况统计表Table 2 Statistical of temperature on spawning and mass hatching of D. helophoroides

2.3 高温胁迫对花绒寄甲成虫体内营养物质含量的影响

2.3.1 高温胁迫对花绒寄甲成虫体内总糖含量的影响 花绒寄甲总糖含量随处理时间总体呈类似“余弦曲线”的波动趋势，即呈先下降后上升趋势（图4a），表明总糖含量随时间（1～6 h，初期）呈逐步降低趋势，随后（6～12 h，中期）呈逐渐上升趋势，此后（12～24 h，后期）又呈下降趋势；与上述处理相比，对照处理（25 ℃）下的变化趋势较为平直，幅度相对较小。在高温胁迫下，当温度升高（33～42 ℃）时，其总糖含量的最低值出现的时间（1～6 h）各不相同，表明昆虫个体在初期对高温的响应速度与处理温度有关，即温度越高，响应越快；经过最低值后，总糖含量随着高温持续时间延长而总体上呈现快速上升后下降趋势，在12 h几乎同步达到各自最大值，温度越高，上升速度越快，总糖含量越高。

2.3.2 高温胁迫对花绒寄甲成虫海藻糖含量的影响 与对照（25 ℃）相比，高温处理能够显著提高花绒寄甲体内海藻糖含量（P＜0.05）（图4b）。其中，花绒寄甲在高适温区（33 ℃和39 ℃）和致死高温区（42 ℃）处理下海藻糖含量变化幅度和趋势差异较大，前者表现为先上升再下降直到平缓趋势，但变化幅度则显著强于对照（F3,8＝32.221，P＜0.05）；42 ℃处理的海藻糖含量变化波动明显，表现为在初始阶段（≤1 h）海藻糖含量显著高于对照和其他处理（P＜0.01），初期（1～3 h）呈下降趋势，3 h下降到39 ℃的水平，此后（3～6 h）迅速达到最大值后又呈下降趋势，至24 h降至对照水平。

2.3.3 高温胁迫对花绒寄甲成虫甘油三酯含量的影响 与对照（25 ℃）相比，高适温区处理（33 ℃和39 ℃）能够显著提高花绒寄甲成虫体内甘油三酯含量（P＜0.01）（图 4c），且二者都与对照具有相似的变化趋势；但含量与变化幅度表现为39 ℃＞33 ℃＞25 ℃，表明高适温区的处理温度越高，甘油三酯含量越高。但在致死高温区（42 ℃），甘油三酯含量变化与高适温区及对照处理在1～12 h内具有相反的变化趋势（降-升-降-升），仅在12～24 h时变化趋势与高适温区处理相似，表明其在42 ℃处理的早、中期对甘油三酯的合成代谢方式不同于高适温区处理。

图4 不同高温胁迫下花绒寄甲营养物质含量的动态变化Fig. 4 Dynamic changes of nutrient contents in D. helophoroides under different high temperature stress

2.4 高温胁迫对花绒寄甲成虫抗氧化酶的影响

2.4.1 高温胁迫对花绒寄甲成虫过氧化物酶（POD）活性的影响 对照条件下，花绒寄甲POD活性在1～24 h内总体呈降低趋势（图5a）。在高适温区，两种处理（33 ℃和39 ℃）的POD活性都呈先下降后上升的变化趋势，但二者也存在显著差异（F3,8≤142.654，P＜0.05），比如在处理初期（1～3 h），温度越高时花绒寄甲POD活性则越低，但在中后期（3～12 h）温度越高，POD活性越高。在致死高温（42 ℃）处理中，POD活性呈类似“余弦曲线”趋势，在1～3 h时与39 ℃处理呈现相似的变化动态，二者并无显著差异；但在3～24 h内，其POD活性与高适温区处理具有不同趋势，先在12 h迅速达到最大值，然后呈迅速下降趋势，最终（24 h）显著低于其他处理，接近3 h时的水平。

2.4.2 高温胁迫对花绒寄甲成虫超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响 在对照条件下，花绒寄甲SOD活性处于相对稳定水平；但在高温胁迫下，花绒寄甲SOD活性显著高于对照（F3,8＝9.695，P＜0.05）（图5b），表明高温处理能够诱导花绒寄甲SOD活性的提高。其中，两种高适温区（33 ℃和39 ℃）处理下SOD活性都呈相似的缓慢增长趋势，且二者没有显著差异（P＜0.05）；但在致死高温区（42 ℃）处理中，SOD活性变化呈现异常波动趋势，诱导SOD活性迅速在1～3 h达到最高值，且显著高于高适温区两种处理（P＜0.01），此后（3～24 h）随高温胁迫时间延长，SOD活性继续呈显著下降趋势，并接近对照水平（图5b）。

2.4.3 高温胁迫对花绒寄甲成虫过氧化氢酶（CAT）活性的影响 无论是高温胁迫还是对照，花绒寄甲CAT活性在1～24 h都呈逐渐增加趋势（F3,8＝29.085，P＜0.05，图5c），但高适温区处理（33 ℃和39 ℃）在初始阶段（1～3 h）都显著高于对照，在3～24 h后无显著差异（P＜0.05）。值得注意的是，致死高温（42 ℃）处理下CAT活性在1～6 h内显著高于对照处理，并在6～24 h内显著低于对照。

图5 不同高温胁迫下花绒寄甲抗氧化酶活性的动态变化Fig. 5 Dynamics of antioxidant enzyme activities in D. helophoroides under different high temperature stress

3 讨论

花绒寄甲在我国是一个典型的自然广布种，对我国南北巨大温差和极端温度具有广泛适应性。近来在福建研究发现花绒寄甲商品化种群的寄生率极低[43,44]，且近年来当地夏季高温频发（如2020年调查发现，我国福建局部夏季（7月）日平均气温为35.0 ℃，最高达43.4 ℃（闽侯榜上水库附近），先后持续8 d）（http://www.weather. com.cn/），据此推测高温胁迫可能是花绒寄甲种群稳定性与寄生率的制约因素之一。观察发现，花绒寄甲成虫在释放初期一般停留于马尾松树干表面或树皮缝隙中，此时林间温度一般略低（1～2 ℃）于林外温度；随后成虫可能沿树体表面爬行搜寻松墨天牛侵入孔，或向其它树体迁飞搜寻寄主，此时完全裸露于空气中，其环境温度也接近于林外温度，受到高温胁迫的影响较大，因此建议不宜在高温季节（7—8月）于林间释放花绒寄甲。当花绒寄甲成虫通过松墨天牛侵入孔进入树体内部蛀道后，蛀道内外部环境温差约2 ℃，与林内外温差相近，但仍属高适温范围，由于持续时间不长（4～6 h），故对蛀道内花绒寄甲的影响较小，一般不会对成虫的后期生殖及子代发育造成伤害。当然，评价花绒寄甲林间防治效果，除考虑局部区域或特定季节持续性极端高温天气[32]影响外，还需要综合考虑其它因素：一是林间寄主的种群规模及虫态[39]；二是花绒寄甲有不同生物型，即寄生针叶树蛀干害虫（如松褐天牛等）、阔叶树蛀干害虫（如栗山天牛等），两者不能交叉使用，否则寄生率极低[40]；三是释放花绒寄甲卵效果不如成虫稳定[41]；四是长期依赖同一寄主繁殖后代，可能导致种群退化和寄生率下降[42]，继而影响控害效果。同时，结合前人的研究结果[21]优化获得新的半致死曲线，有利于进一步构建更科学的评价方法与体系。然而，本研究只是在理想的可控单因素条件下进行的，与野外实际情况并不完全一致，因为在自然条件下，由于昼夜节律的影响，长期高温不会持续性发生，多为短暂性、波动性的高温，，但对花绒寄甲的高温适应性及控害潜能的科学评价仍具有积极意义，今后需补充研究花绒寄甲对短时、波动性高温条件下适应性，以便进一步优化评价方法。

昆虫应对高温胁迫的生理生化机制是复杂的，如瓜实蝇Bactrocera cucurbitae在面临逆境胁迫时，需消耗大量糖类物质提供其生存和发育[28]，本研究也发现花绒寄甲总糖含量随着时间推移呈先降后增趋势，说明花绒寄甲在高温初期对糖类代谢需求量大，可能与其剧烈的活动行为有关；此后随着适应性增加，体内糖类物质又逐渐积累，有利于提高其饥饿耐受性。但在致死高温处理（42 ℃）下，供试昆虫总糖的合成与代谢速率都处于较高水平，且代谢速率更快，以应对极端高温胁迫。海藻糖也是昆虫生命活动中重要的糖类物质之一，与昆虫的免疫代谢途径密切相关，主要参与昆虫血淋巴的贮存、胚胎发育等重要生理活动[29]。经测定发现，花绒寄甲的海藻糖含量随着温度的升高而增加，在初、中期尤为明显，这一研究结果与双斑长跗萤叶甲Monolepta hieroglyphica在高温环境（33～35 ℃）中的海藻糖含量变化趋势相似[30]，表明海藻糖也参与了花绒寄甲在高温胁迫下生理活动，并受到高温适应机制的分子调控；但42 ℃处理下海藻糖含量变化趋势与高适温区处理相反，可能与供试昆虫剧烈活动和异常代谢有关。脂质（以甘油三酯为主）作为昆虫主要的能源物质之一，其含量变化趋势代表其行为活跃和能量消耗程度，当温度过高时则会阻断能源物质转化为能量的途径，导致甘油三酯含量下降[31]。前人发现花绒寄甲在高温条件（30～35 ℃）下飞行距离增加，从行为学上揭示了其在高温环境下体内甘油三酯含量增加的证据。据此推测，在一定的高温条件下，花绒寄甲大量脂类能量主要提供于迁飞和扩散行为，较少供给卵巢发育和生殖行为[32]；尤其在42 ℃处理下甘油三酯含量在接近对照处理的水平波动，处于较为紊乱的状态，显然过高的温度虽然提高甘油三酯的合成水平，但此后抵御高温需要付出更大的能量代价，从而在总体上呈现异常的波动趋势，也可能与成虫体内甘油三酯含量的内在特性或成虫的剧烈活动有关。

一般地，昆虫经历高温胁迫后，导致昆虫体内超氧阴离子自由基的含量急剧上升，作为抗氧化系统的第一道防线，SOD首先清除过量的超氧阴离子自由基[33]，维持机体生理活动。高适温胁迫诱导花绒寄甲SOD活性显著升高，并在1～24 h间略呈上升趋势，以清除体内过高的氧化水平，提高花绒寄甲对高温胁迫的适应性。但在致死高温（42 ℃）处理下，诱导体内超氧阴离子自由基的含量迅速（1～3 h）上升，以消除超氧自由基的伤害，故SOD活性也显著高于高适温及对照处理（P＜0.01）；但随后（3～12 h）当高温胁迫及持续时间超过了自身所承受的范围后，SOD活性水平呈迅速下降趋势，一方面由于昆虫体内的代谢机能受到直接破坏，同时SOD活性本身亦会受到高温抑制所致，也可能与其在致死高温下的剧烈活动有关；后期体内SOD活性继续下降至对照水平，呈现了花绒寄甲应对致死高温特定的表现形式，可能与减少活动及生理调适有关。POD和CAT也会共同作用清除SOD分解产生的H2O2，POD主要负责清除低浓度的H2O2，CAT 清除高浓度H2O2[34,35]。研究发现，高温胁迫下SOD含量逐渐增加，初期逐渐产生低浓度的H2O2，花绒寄甲需要消耗POD分解产生的H2O2，导致POD活性迅速显著下降；此后随SOD分解产生H2O2并不断累积，CAT取代POD负责清除高浓度H2O2，间接导致POD活性逐渐增加，与雌性意大利蝗Calliptamus italicus在高温（30～48 ℃）胁迫下POD和CAT活性的变化趋势类似，推测高温胁迫威胁花绒寄甲生存时，其体内的抗氧化物酶起着调节和保护的作用[36]。但致死高温胁迫处理在中后期则有所不同，SOD含量迅速升高导致高浓度H2O2形成，POD消耗下降导致POD活性逐渐增加；此后CAT参与了清除高浓度的H2O2，还间接消耗了SOD含量，导致SOD含量下降，这一过程最终产生了低浓度SOD，又消耗了POD导致活性下降，这与玉米象Sitophilus zeamais在43 ℃下抗氧化酶活性变化具有类似的结果[37]。此外，CAT的活性与高浓度的H2O2直接相关，H2O2的浓度则与SOD及POD间接相关。花绒寄甲的高适温及对照处理的SOD及POD变化趋势相对平稳，从而决定其CAT活性变化趋势也较为平滑，类似逻辑斯蒂曲线。值得注意的是，对照的CAT变化在3～6 h时也增加了近3倍，这一变化与短时高温对二点委夜蛾Athetis lepigone(Moschler）体内CAT活性的影响类似[38]。

综上，高温胁迫会降低商品化花绒寄甲成虫个体寿命，温度过高时严重影响其成虫产卵行为和卵块孵化率。同时，花绒寄甲成虫对高适温区的胁迫具有一定的适应性，可能与其体内含有大量营养物质和抵抗逆境胁迫的酶类有关，但是随着胁迫时间延长，花绒寄甲体内营养物质消耗加剧，同时引起花绒寄甲体内抗氧化酶类的降解，导致花绒寄甲死亡率急剧升高，不利于种群定居和繁衍；对亚致死高温区及致死高温区的温度的耐受性极弱，个体随胁迫时间延长迅速死亡。显然，花绒寄甲在生物学、生理学上都无法适应42 ℃及以上高温胁迫，采用高适温处理（33～39 ℃）进行逐级驯化，可以诱导花绒寄甲抗氧化酶活性上升，并随着处理时间延长，有利于花绒寄甲商品化种群的驯化，以提高成虫对高温胁迫的耐受性，获得适应高温的花绒寄甲种群，有望提升其对松墨天牛控害效能，具有重要实践意义。