柱前衍生RP-HPLC检测三七中三七素和18种游离氨基酸

黄海霞，徐 怡，牛延菲，王 鹏，闵莎位，付晓云

(1 昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室，云南 昆明 650500；2 云南省药物研究所，云南 昆明 650111)

三七(Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen)属五加科人参属多年生草本植物，多以根、根茎入药[1]，主要产于我国云南省，有化瘀止血，活血定痛等功效[2]，知名的云南白药，其主要原料就是三七。三七(Panaxnotoginseng(Burk.)FH.Chen)化学成分复杂,研究结果表明, 三七中含有皂苷、黄酮、多糖、挥发油、氨基酸、环二肽及蛋白质等化合物[3-4]。目前研究者测定三七中氨基酸含量多采用氨基酸自动分析仪[5-8]，但该仪器价格昂贵，局限性大，且对三七进行强烈酸水解测定氨基酸含量，其氨基酸含量已包含大部分蛋白质、肽中氨基酸含量。有研究者以PITC为衍生剂，采用柱前衍生化RP-HPLC法测定三七与三七药渣中游离氨基酸的含量[9-10]。本研究以2,4-二硝基氟苯(FDNB)为衍生化试剂，建立柱前衍生RP-HPLC法测定三七不同部位中三七素和18种游离氨基酸含量。

1 实 验

1.1 仪 器

Waters e2695高效液相色谱仪：四元泵，DAD检测器，自动进样器，在线真空脱气机，智能化柱温箱及Empower化学工作站，沃特世公司；AG285型电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；SK250HP超声波清洗仪，上海科导超声仪器有限公司；HH-6数显恒温水浴锅，常州智博瑞仪器制造有限公司。

1.2 试 剂

L-三七素(批号为190215-169，纯度：99.17%)，昆明森岚科技有限公司；18种氨基酸对照品(批号为140624-200805，分别为：精氨酸；缬氨酸；甘氨酸；组氨酸；盐酸赖氨酸；异亮氨酸；丝氨酸；门冬氨酸；苯丙氨酸；胱氨酸；苏氨酸；丙氨酸；色氨酸；酪氨酸；亮氨酸；脯氨酸；以上氨基酸纯度：100%；甲硫氨酸纯度：99.7%；谷氨酸纯度：99.5%)，中国食品药品检定研究院。0.1 mol/L HCl：4 mL盐酸与480 mL水混合；0.5 mol/L NaHCO3：2.1 g NaHCO3溶于50 mL水中；1% FDNB：1 g FDNB溶于100 mL乙腈中；0.1 mol/L磷酸盐缓冲溶液: 0.7122 g无水磷酸氢二钠和0.3643 g磷酸二氢钾，加入水溶解定容至100 mL，pH 6.9；盐酸、碳酸氢钠、2,4-二硝基氟苯(FDNB)、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、无水乙酸钠、冰醋酸均为分析纯；乙腈为色谱纯；水为超纯水。

1.3 样 品

30批三七样品,主根、剪口、筋条、茎叶为净饮片，花为药材,每个部位6批，均经过云南省药物研究所天然药物资源研究中心高级工程师 王丽、朱高倩鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：SymmetryShieldTM RP18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相以乙腈-水(1：1)为流动相A，50 mmol/L乙酸钠缓冲液(以冰醋酸调至pH 6.5)为流动相B按表1梯度进行洗脱；流速1.0 mL/min，检测波长360 nm；进样量20 μL；柱温30 ℃。

表1 洗脱梯度

2.2 对照品储备液的制备

对照品储备液的制备：精密称取19种氨基酸对照品于50 mL容量瓶中，加0.1 mol/L的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，即得19种氨基酸对照品储备液(三七素：0.1057 mg/mL；精氨酸：0.1090 mg/mL；缬氨酸：0.1058 mg/mL；谷氨酸：0.1361 mg/mL；甘氨酸：0.1196 mg/mL；组氨酸：0.1186 mg/mL；盐酸赖氨酸：0.1266 mg/mL；异亮氨酸：0.1136 mg/mL；丝氨酸：0.1048 mg/mL；门冬氨酸：0.1286 mg/mL；甲硫氨酸：0.1073 mg/mL；苯丙氨酸：0.1176 mg/mL；胱氨酸：0.1104 mg/mL；苏氨酸：0.1328 mg/mL；丙氨酸：0.1686 mg/mL；色氨酸：0.1088 mg/mL；酪氨酸:0.1204 mg/mL；亮氨酸：0.1040 mg/mL；脯氨酸：0.1206 mg/mL)。

精密移取氨基酸储备液1.0 mL，置10 mL棕色容量瓶中，精密加入0.5 mol/L NaHCO3溶液1.0 mL,摇匀，再精密加入1% DNFB溶液1.0 mL, 摇匀，置60 ℃水浴中加热60 min，放冷，用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.9)定容至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.3 供试品溶液制备方法

2.3.1 供试品溶液的制备

取样品粉末0.5 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，精密加入0.1 mol/L的盐酸50 mL，称定重量，超声90 min，放冷，再称定重量，用0.1 mol/L的盐酸补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液1.0 mL，置10 mL棕色容量瓶中，精密加入0.5 mol/L NaHCO3溶液1.0 ml，摇匀，再精密加入1% DNFB溶液1.0 mL, 摇匀，置60 ℃水浴中加热60 min，放冷,用0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.9)定容至刻度，摇匀，用0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.3.2 空白溶液

不加样品，按“3.3.1”项下供试品溶液的制备同法制备，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性考察

取混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶液各20 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果19种氨基酸色谱峰分离度良好，空白无干扰，见图1。

图1 系统适应性图谱

2.4.2 线性范围的考察

配制不同浓度的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，以19种氨基酸的进样浓度(mg/mL)为横坐标(X)进行线性回归，得19种氨基酸的回归方程，见表2，结果表明在表2范围内线性关系良好。

表2 19种氨基酸标准曲线表

续表2

2.4.3 精密度试验

取“2.2”项中衍生后的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录19种氨基酸的峰面积，19种氨基酸峰面积的RSD在0.034%～1.862%之间(n=6)，结果表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验

取“2.3.1”项下的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于 0，4，8，12，24 h进样分析，测定峰面积，19种氨基酸峰面积的RSD在0.854%～2.961%之间(n=5)，结果表明溶液的稳定性良好。

2.4.5 重复性试验

按“2.3.1”项下方法制备供试品溶液，取同一批样品分别平行制备6份供试品溶液，衍生后取20 μL 注入色谱仪，测19种氨基酸的峰面积并计算含量，19种氨基酸含量的RSD在0.454%～3.943%之间(n=6)，结果表明试验的重复性良好。

2.4.6 加样回收试验

取已知各氨基酸含量的样品9份，各0.25 g，精密称定，分别加入适量的标准品溶液，按“2.3.1”项下自“精密加入0.1 mol/L的盐酸50 mL，称定重量，超声90 min”起操作，制备所需溶液，按上述色谱条件进样分析，计算各氨基酸回收率，19种氨基酸的平均回收率在88.771%～104.760%之间，RSD在2.731%～5.454%之间(n=9)，说明该方法的准确度较好。

2.4.7 范 围

精密称取同一批样品0.4 g，0.5 g，0.6 g，按“2.3.1”项下自“精密加入0.1 mol/L的盐酸50 mL，称定重量，超声90 min”起操作，制备所需溶液，按上述色谱条件进样分析，测19种氨基酸的峰面积并计算含量，19种氨基酸含量的RSD在0.464%～4.202%之间(n=3)，结果表明取样量在80%～120%区间，该方法能准确测定样品中19种氨基酸含量。

2.5 样品测定

按照确定的方法测定30批不同部位三七样品中游离氨基酸的含量，结果见表3。

表3 不同部位三七中游离氨基酸的含量

3 讨 论

(1)本研究以牛血清白蛋白为样品，按“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样分析，测19种氨基酸的峰面积，19种氨基酸的峰面积为0，结果表明该方法未使蛋白质发生水解，即所测三七样品中的氨基酸为游离氨基酸。

(2)有研究者采用2,4-二硝基氟苯(FDNB)柱前衍生HPLC法测定三七中的三七素含量[11]，但尚未有研究者采用2,4-二硝基氟苯(FDNB)作为柱前衍生剂对三七中游离氨基酸进行测定；有研究者采用亲水作用色谱串联质谱法同时分析了三七药材中三七素及其他游离氨基酸类成分[12]，操作复杂，本研究以2,4-二硝基氟苯(FDNB)为衍生化试剂，经与三七中氨基酸柱前衍生，并以高效液相色谱法同时对三七中三七素及18种游离氨基酸进行测定。结果表明该方法灵敏、准确，具有良好的重复性和重现性，适用于对三七中的氨基酸含量进行研究，可为三七药材的质量控制和评价提供科学依据。

(3)三七中游离氨基酸成分以精氨酸最丰富[5-6,13]，精氨酸作为半必需氨基酸，缺乏精氨酸会导致血氨过高影响机体正常的生长和发育[14]。三七素是三七中特殊的氨基酸类成分，也是三七止血功效的主要活性成分[15]。本研究采用柱前衍生HPLC技术测定了三七不同部位中19种氨基酸，从表3可以看出，三七不同部位中氨基酸的含量存在差异，三七花中氨基酸含量最高，三七素作为三七止血功效的主要活性成分在三七花中含量也为最高，其次为筋条、剪口、主根，三七茎叶中也有较高含量三七素，说明三七花、三七茎叶均能作为三七素提取原料，今后应加强对其开发研究，以提高三七的综合利用率。

4 结 论

以2,4-二硝基氟苯(FDNB)为衍生化试剂柱前衍生RP-HPLC法灵敏、准确，具有良好的重复性和重现性，适用于对三七中的游离氨基酸含量进行研究，可为三七药材的质量控制和评价提供科学依据。三七不同部位氨基酸的含量存在差异。