miR-448靶向SIRT1对血管平滑肌细胞增殖、凋亡和运动能力的调节作用①

朱彦彬 李 立 王贤芝 仲 伟 张富钊

(川北医学院附属医院血管外科，南充 637000)

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)是动脉中膜的重要组成部分，是执行血管收缩功能的重要物质基础[1]。临床研究表明，VSMCs异常增殖与多种心血管疾病(动脉粥样硬化、冠心病和冠脉支架内再狭窄等)的发生发展相关[2]。研究调节VSMCs细胞生物学行为的关键因子对心血管疾病治疗具有重要意义。沉默信息调节蛋白1(silencing information regulatory protein 1，SIRT1)是Sirtuin家族成员，可调节氧化应激、炎症和自噬等生理过程，对动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤等具有预防保护作用[3]。研究显示，SIRT1可抑制VSMCs增殖及血管炎症反应，但其上游调节机制尚未明确[4-5]。miR-448属于miRNA家族，可与靶mRNA的3′UTR互补结合抑制多种蛋白翻译，调控细胞增殖、分化和凋亡过程[6]。miR-448可调节SIRT1表达，参与2型糖尿病发生发展，但其对VSMCs的作用及机制报道较少[7]。本研究分析miR-448和SIRT1的靶向关系及其对VSMCs细胞生物学行为的调节作用，为心血管疾病治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 SPF级SD雄性大鼠20只，体重250～280 g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2017-0022，饲养于我院动物中心实验室，每12 h更换光照条件，保持室温恒定为25℃，自由摄食与饮水。

1.1.2仪器 FACSCantoⅡ流式细胞仪(美国BD公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司)。

1.1.3试剂 DMEM培养基、胎牛血清及转染试剂(赛默飞世尔)；荧光素酶检测试剂盒(美国Promega公司)；EDU试剂盒(广东锐博生物科技有限公司)；MTT检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)；Transwell小室、Matrigel基底膜(美国BD公司)；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂(日本TaKaRa公司)；抗GAPDH抗体、抗α-SMA抗体、抗Ki67抗体、抗PCNA抗体、抗Caspase-3抗体、抗Caspase-9抗体、抗MMP-2抗体及抗MMP-9抗体(美国Santa Cruz公司)。

1.2方法

1.2.1造模 SD大鼠预饲养1周后，随机分为对照组和模型组，每组10只。参考文献[8]建立颈动脉损伤模型：大鼠腹腔注射10%水合氯醛(6 ml/kg)麻醉，剃除颈部皮毛，75%酒精局部消毒，分离皮下组织和肌肉，暴露颈内动脉、颈外动脉、颈总动脉，颈外动脉远心端打死结，动脉夹临时结扎颈内动脉和颈总动脉近心端，显微剪在颈外动脉剪1个小口，沿颈外动脉将2.0 F球囊送至颈总动脉，注射生理盐水充盈球囊，反复抽拉3次后放气，撤出球囊，待颈动脉血流恢复后依次缝合，对照组仅暴露颈动脉后即缝合伤口。术后14 d腹腔麻醉处死大鼠，分离颈全部总动脉。

1.2.2大鼠颈动脉组织VSMCs细胞分离培养与鉴定 将颈总动脉放入D-Hanks液中洗清残血，血管放入2 mg/ml Ⅱ 型胶原酶和高糖细胞培养基(1∶1)中，37℃温浴15 min，剥去血管表面筋膜和纤维层，置于含1%青霉素-链霉素和10%胎牛血清的高糖培养基，37℃孵育过夜，分别加入1 ml Ⅱ型胶原酶(2 mg/ml)和弹力蛋白酶(0.25 mg/ml)于6孔板，剪碎，37℃孵育1 h，枪头吹打后离心，重悬，细胞生长至 80%融合(7～10 d)传代。采用α-SMA单克隆抗体进行免疫荧光鉴定，取培养到第2代的对数期细胞，弃培养基，加入1 ml 4%多聚甲醛固定20 min，加入 0.25 % Triton X-100 室温透膜 1 h，加入含 10%山羊血清的封闭液室温封闭1 h，加入羊抗鼠α-SMA 一抗(1∶ 200)4℃孵育过夜，加入Alex488 兔抗羊二抗(1∶1 000)4℃孵育过夜，加入DAPI 染核，室温避光10 min，倒置荧光显微镜下观察。

1.2.3RT-PCR、Western blot检测大鼠颈动脉组织VSMCs miR-448和SIRT1表达 取各组大鼠VSMCs，Trizol法提取组织总RNA，RT-PCR反应，以GAPDH为内参，参考文献[9-10]设计引物、反应体系及条件。采用细胞裂解液严格按照蛋白裂解步骤提取总蛋白，将50 μg蛋白样品经SDS-PAGE电泳转至PVDF膜，加入一抗4℃孵育过夜，加二抗37℃孵育2 h，ECL显色。Photoshop软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.4miR-448和SIRT1靶向关系研究 将体外分离培养的正常大鼠VSMCs接种于细胞培养板，24 h后分别转染miR-448 mimic和miR-448 inhibitor。RT-PCR测定各VSMCs中miR-448表达。Western blot检测SIRT1蛋白表达。荧光素酶报告基因系统研究miR-448和SIRT1靶向关系，miRNA靶点预测软件提示，miR-448的可能结合位点为SIRT1 mRNA的3′UTR 位点906～913，体外合成含该位点的DNA片段(wt)及含该位点突变体(mut)的DNA片段，亚克隆至双荧光素酶启动子载体。将该质粒转染于miR-448组和miR-448 inhibitor组细胞，培养48 h，荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶活性。

1.2.5细胞培养与转染 将体外分离培养的正常大鼠VSMCs分为miR-448组、miR-SIRT1组、SIRT1组和对照组。采用Lipofectamine 2000转染miR-448 mimic，转染前24 h接种细胞，将miR-448 mimic转染于miR-488组和miR-SIRT1组细胞；将SIRT1构建至pc-DNA 3.1载体过表达后转染至miR-SIRT1组和SIRT1组细胞，按照转染试剂操作步骤进行转染。

1.2.6EDU染色检测细胞的增殖 取转染后各组VSMCs，按照EDU试剂盒说明书进行EDU染色，于荧光显微镜下观察细胞增殖情况，Image-pro Plus软件计算。Western blot检测Ki67、PCNA蛋白表达。

1.2.7流式细胞术检测细胞的凋亡 取转染后各组VSMCs，离心管收集细胞培养液及胰酶消化后的细胞，2 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS重悬并计数。取5×104～1×105个/ml重悬细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，依次加入195 μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞，5 μl Annexin V-FITC轻轻摇匀，10 μl Propidium Iodide染色液混匀。室温避光孵育30 min，流式细胞术检测。Western blot检测Caspase-3和Caspase-9蛋白表达。

1.2.8Transwell检测细胞侵袭 取100 μl稀释好的基质胶均匀覆盖于Transwell小室底部。取转染后各组细胞，0.2%胰蛋白酶消化，以含1%小牛血清的培养液调整细胞浓度为2×105个/ml。取100 μl 稀释好的细胞悬液加于上室，下室为500 μl含10%胎牛血清培养基，37℃、5%CO2培养48 h，取出小室，按照Hemacolor Kit说明书固定、染色，下室面表面细胞为侵袭细胞，显微镜下拍照、计数，共计数5个视野，取平均值。实验设置3个平行小室，重复3次，以穿膜的肿瘤细胞数评价其侵袭能力。

1.2.9划痕实验检测细胞迁移 取转染后各组VSMCs接种于96孔板，待细胞长满单层弃培养基，灭菌移液枪头在皿底划一直线，洗涤3次，尽量清洗掉被划下的细胞，更换无血清培养基常规培养，显微镜下观察划痕处细胞生长情况，根据划痕宽度计算细胞迁移率。Western blot检测MMP-2和MMP-9蛋白表达。

2 结果

2.1各组大鼠动脉损伤组织VSMCs分离鉴定 正常组织和动脉损伤组织VSMCs中均可见α-SMA阳性信号，表明所分离细胞为VMSCs。见图1。

2.2miR-448和SIRT1在动脉损伤组织VSMCs中的表达 与对照组相比，动脉损伤组织VSMCs中miR-448表达明显上调(P<0.05)，SIRT1表达明显下调(P<0.05)。见图2。

2.3miR-448靶向抑制SIRT1表达 与对照组相比，miR-448组miR-448表达明显上调(P<0.05)，SIRT1表达明显下调(P<0.05)，miR-448 inhibitor组miR-448表达明显下调(P<0.05)，SIRT1表达明显上调(P<0.05)。荧光素酶报告系统实验结果显示，共转染野生型荧光素酶质粒和miR-448，荧光素酶活性显著降低(P<0.01)，表明miR-448可靶向负调控SIRT1，见图3。

2.4miR-448靶向抑制SIRT1促进VSMCs增殖 EDU细胞增殖实验显示，与对照组相比，miR-448组细胞数明显增多(P<0.05)，SIRT1组细胞数明显减少(P<0.05)；与SIRT1组相比，miR-SIRT1组细胞数明显增多(P<0.05)。Western blot显示，与对照组相比，miR-448组Ki67和PCNA蛋白表达明显上调(P<0.05)，SIRT1组Ki67和PCNA蛋白表达明显下调(P<0.05)；与SIRT1组相比，miR-SIRT1组Ki67和PCNA蛋白表达明显上调(P<0.05)，见图4。

2.5miR-448靶向抑制SIRT1抑制VSMCs凋亡 流式细胞术结果显示，与对照组相比，miR-448组细胞凋亡率明显下降(P<0.05)，SIRT1组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)；与SIRT1组相比，miR-SIRT1组细胞凋亡率明显下降(P<0.05)。Western blot显示，与对照组相比，miR-448组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达明显下调(P<0.05)，SIRT1组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达明显上调(P<0.05)；与SIRT1组相比，miR-SIRT1组Caspase-3和Caspase-9蛋白表达明显下调(P<0.05)，见图5。

图1 各组大鼠动脉损伤组织中VSMCs分离鉴定Fig.1 Isolation and identification of VSMCs in artery injury tissues of rats

图2 miR-448和SIRT1在正常组织与动脉损伤组织VSMCs中的表达Fig.2 Expression levels of miR-448 and SIRT1 in VSMCs of normal tissues and arterial injury tissuesNote:Compared with Control,*.P<0.05.

图3 miR-448对SIRT1 表达的靶向调控作用Fig.3 Effect of miR-448 on targeting expression of SIRT1Note:Compared with Control,*.P<0.05;compared with SIRT1 wt,#.P<0.05.

图4 miR-448靶向抑制SIRT1对VSMCs增殖的影响Fig.4 Effect of miR-448 targeting inhibiting SIRT1 on proliferation of VSMCsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with SIRT1,#.P<0.05.

图5 miR-448靶向抑制SIRT1对VSMCs凋亡的影响Fig.5 Effect of miR-448 targeting inhibiting SIRT1 on apoptosis of VSMCsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with SIRT1,#.P<0.05.

图6 miR-448靶向抑制SIRT1对VSMCs细胞侵袭和迁移的影响Fig.6 Effect of miR-448 targeting SIRT1 on inhibit invasion and migration of VSMCsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with SIRT1,#.P<0.05.

2.6miR-448靶向抑制SIRT1促进VSMCs侵袭和迁移 与对照组相比，miR-448组细胞侵袭率和迁移率明显升高(P<0.05)，SIRT1组细胞侵袭率和迁移率明显下降(P<0.05)；与SIRT1组相比，miR-SIRT1组细胞侵袭率和迁移率升高(P<0.05)。Western blot显示，与对照组相比，miR-448组MMP-2和MMP-9蛋白表达明显上调(P<0.05)，SIRT1组MMP-2和MMP-9蛋白表达明显下调(P<0.05)；与SIRT1组相比，miR-SIRT1组MMP-2和MMP-9蛋白表达明显上调(P<0.05)，见图6。

3 讨论

miR-448属于miRNAs家族，参与冠状动脉粥样硬化、前列腺癌、乳腺癌等多种疾病的发生。LI等[11]研究发现，过表达miR-448可促进VSMCs增殖和迁移，在多种心血管疾病(冠心病、动脉粥样硬化、高血压等)中具有重要作用，但作用机制尚未明确。本研究建立大鼠颈动脉损伤模型，分析miR-448作用于VSMCs的机制。本研究中，动脉损伤组织VSMCs中miR-448表达明显上调，SIRT1表达明显下调，且经荧光素酶活性实验证实miR-448可靶向负调控SIRT1表达，提示miR-448可能通过靶向负调控SIRT1表达调控VSMCs生物学行为，参与动脉组织损伤的病理过程。SIRT1作为Sirtuins家族成员，参与多种细胞过程，如能量代谢、DNA修复、氧化应激等[12]。研究表明，SIRT1可调节VSMCs功能紊乱，在血管的生长发育中具有重要作用[13]。提示miR-448可通过靶向负调控SIRT1表达调节VSMCs功能，导致动脉组织损伤。

VSMCs异常增殖是高血压、动脉粥样硬化、冠心病等疾病发生发展的细胞病理学基础[14]。本研究发现，miR-448可靶向抑制SIRT1表达上调Ki67和PCNA蛋白表达，促进VSMCs细胞增殖。Ki67和PCNA为细胞增殖蛋白，是目前反映肿瘤细胞增殖活性和增殖速率最可靠的指标，与多种恶性肿瘤的发展及预后有关[15]。提示miR-448可通过抑制SIRT1表达上调细胞增殖蛋白表达，促进VSMCs增殖。WANG等[16]研究发现，SIRT1可抑制损伤的VSMCs增殖，促进其凋亡，与本研究结果基本相符，提示miR-448可通过靶向抑制SIRT1表达。促进VSMCs增殖，增加高血压、冠心病等心血管疾病发生风险。本研究中，miR-448可靶向抑制SIRT1表达，下调Caspase-3和Caspase-9蛋白的表达，抑制细胞凋亡，提示miR-448可靶向抑制SIRT1表达，抑制细胞凋亡的级联反应，抑制VSMCs凋亡。

临床研究表明，损伤诱导的VSMCs由中膜向内膜迁移、增殖、分泌大量细胞外基质等是导致血管重构的重要病理基础[17]。本研究发现，miR-448可靶向抑制SIRT1表达，上调MMP-2和MMP-9蛋白表达，抑制VSMCs侵袭和迁移。MMP-2和MMP-9所有MMPs中分布最广，可特异性降解Ⅳ型胶原纤维，其中MMP-9还可以释放血管内皮生长因子参与血管生成，在调节细胞增殖、侵袭、转移及血管生成等方面具有重要作用[18-19]。KITADA等[20]研究表明，SIRT1在VSMCs侵袭和迁移中具有重要作用，与本研究结论基本相符，提示miR-448可靶向抑制SIRT1表达，上调MMP-2和MMP-9表达，促进VSMCs侵袭和迁移，增加血管重构风险。

综上所述，miR-448可靶向负调控SIRT1表达，促进VSMCs增殖、侵袭和迁移，抑制其凋亡，为心血管疾病的研究和防治提供了理论基础。