c-Met抑制剂联合氟尿嘧啶对结直肠癌细胞SW620增殖及凋亡的影响

陈婷婷，刘 伟，武 伟，来卫东，刘琳琳*

(1山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000；2山东医专附属医院；3临沂市中心医院)

结直肠癌具有发病隐匿、发展速度快、恶性程度高等特点，目前其临床疗法主要包括手术、化疗、放疗，然而不佳。20世纪中期以来，临床普遍将氟尿嘧啶(5-FU)用做该病的基本化疗药物，但其单药方案疗效有限。c-Met为肝细胞生长因子(HGF)的受体，能够与分泌自间质细胞的HGF结合，使下游偶联的诸多不同信号途径活化，由此加速肿瘤细胞的增殖、迁移与浸侵[1]。结直肠癌患者c-Met阳性表达率随着病情加重而升高，故采用合适的c-Met抑制剂可实现治疗的作用。但目前尚无c-Met抑制剂联合5-FU对结直肠癌的研究。为此，本研究将c-MET抑制剂SU11274与5-FU联合用于人结直肠癌细胞株SW620，观察对其增殖与凋亡的影响，旨在为临床早期治疗结直肠癌提供依据。

1 材料与方法

1.1细胞分组及给药方法 将SW620细胞分为对照组(C组)、5-FU组( F组)、c-MET抑制剂SU11274组(S组)、5-FU和SU11274联合组(FS组)。F组、S组、FS组分别加入5-FU、SU11274、5-FU+SU11274，均为1μmol/L。

1.2细胞增殖观察 对数生长期细胞胰酶消化处理，把0.1 mL(含细胞量为5×103个)悬液向96孔板内接种，待细胞贴壁，将药物添加至对应的组内。3 d后将0.02 mL、5 mg/mL的MTT添加至各孔，置于细胞培养箱内孵育4 h，10 min离心处理(转速为1200 r/min)，将上清倒掉，向各孔添加0.2 ml的DMSO，0.5 h混合处理，使结晶彻底溶解。530 nm波长下采用酶标仪测量其OD值。计算细胞存活率。3次重复。

细胞存活率(%) = [吸光度(实验组-空白组) /吸光度(对照组-空白组)]×100%。

1.3凋亡细胞检测 6孔板接种1×105个对数生长期细胞，培养1 d。待贴壁，倒掉原培养液，将相关药物相应添加至各组。经过3 d，先胰酶消化，再将所有细胞收集至试管(5 mL)，5 min离心处理(转速为1500 r/min)，将上清倒掉，用生理盐水洗涤。加入Binding Buffer(1×)，使细胞浓度呈1×106/mL，0.1 ml(1×105个细胞)并移入另一试管(5 mL)。各管内加入5 μL的FITC和5 μL的PI，室温、避光15 min。上机前添加Binding Buffer(1×)0.4 ml，60 min内借助流式细胞仪对细胞凋亡状况进行观察。重复3遍。

1.4细胞MMP，Hes1，Notch1蛋白检测 6孔板接种细胞，待密度达对数生长期细胞后，对各组加药干预2 d，0℃裂解细胞，0.5 h离心处理(转速12000 r/min、温度4℃)，收集每组蛋白裂解液，借助BCA法定量蛋白。取30～40 μg蛋白，SDS-PAGE(8%～10%)电泳分离处理，转印至NC膜上，用5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗孵育4℃过夜，TBST洗膜 10 min×3次，二抗室温摇床孵育1 h，用TBST进行5次洗膜，每次用时5 min，显色、曝光成像处理。蛋白相对表达量即为目标蛋白同内参蛋白两者间灰度值之比。

2 结果

2.1各组细胞存活率及凋亡率情况 各组细胞存活率及凋亡率比较有统计学意义，两两比较显示：FS组细胞存活率最低(q=13.98～32.30，P<0.05)，凋亡率最高(q=5.3～75.22，P<0.05)。

表1 各组细胞存活率及凋亡率情况

2.2各组细胞MMP、Hes1及Notch1蛋白的表达 各组在MMP、Notch1与Hes1表达水平上有统计学意义，两两比较显示：FS组均低于其他 各 组

(q=4.20～20.09，P<0.05)，F组与S组之间的MMP、Hes1表达无统计学意义(P>0.05)。

图1 各组细胞中MMP，Hes1，Notch1蛋白表达情况(电泳图)

表2 各组细胞中MMP、Hes1、Notch1蛋白表达的比较

3 讨论

有研究表明，MMP在宫颈癌、胃癌、食管癌、胶质瘤等组织中异常激活[2]。hes1与hath1均属于前神经元碱性螺旋-环-螺旋转录因子家族。研究证实，hes1能够经由信号途径pten/pi3k/akt/mtor使p53此抑癌基因表达下调，由此阻止细胞凋亡。有研究发现，多数结直肠癌组织内notch1、hes1为高表达，同时有着较好的一致性[3]。

本研究将SU11274联合5-FU作用于结直肠癌细胞SW620，结果显示，FS组细胞存活率最低、凋亡率最高；FS组MMP、Hes1及Notch1蛋白相对表达量均低于其他各组。由此可见，二者联合能够对显著抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，表明c-Met抑制剂可使5-FU对结直肠癌细胞SW620的敏感性提升。

Notchl信号途径与生命机体诸多过程密切相关，包括器官形成、胚胎发育等，同时显著影响诸多疾病的形成，包括癌症、动脉粥样硬化、糖尿病肾病等[4]。有研究发现，对Notchl进行抑制可使人脑胶质瘤细胞增殖减弱，反之，使其活化，会加速增殖[5]。此次研究发现，c-Met抑制剂可能通过作用Notchl信号途径，从而对细胞增殖侵袭活性产生影响。