响应面法优化紫草中总萘醌的提取工艺

邓 强，程 烨，苏江涛，柯贤炳

(1 湖北工业大学生物工程与食品学院，湖北 武汉 430068; 2 武汉生物工程学院药学院，湖北 武汉 430068)

紫草(Arnebiaeuchroma)为紫草科植物新疆紫草或内蒙紫草的干燥根，作为药物，始载于《神农本草经》[1]。紫草的有效成分主要有两大类：一类是以萘醌类成分为主的脂溶性成分，另一类是以多糖为主的水溶性成分[2]。其中萘醌类成分具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等作用[3-5]，其提取方法的研究对相关产品的开发和利用具有重要的现实意义。萘醌类成分极性较小，常用的提取溶剂有石油醚、氯仿等有机溶剂和植物油[6-7]。从产品开发的角度考虑，本研究首次选用了橄榄油为提取溶剂。橄榄油是世界公认的优质植物油，含有多种天然生理活性物质[8]，通过提取萘醌类成分制作成的紫草油、紫草膏或润唇膏等，在中药化妆品的开发上将有较大的应用前景。

响应面法(Response surface methodology，RSM)是一种常用于优化中药材提取条件的方法。其运用数学函数进行分析，同时讨论各因素之间的相互作用，从而得出最优的实验条件，具有精度高、预测值精准的优点。本研究采用响应面法优化紫草中总萘醌的提取工艺，为紫草中萘醌类成分的进一步开发、利用提供理论依据。

1 材料

1.1 仪器

粉碎机(吉首市中诚制药机械厂)；超声机(济南巴克超声波科技有限公司)；离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)；UV1800型-紫外分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。

1.2 试剂

新疆紫草(湖北辰美中药有限公司)；左旋紫草素对照品(中国药品生物制品鉴定所，纯度>98%，供鉴别使用)；橄榄油(广州欧博化妆品有限公司，化妆品级别)；无水乙醇(国药集团化学试剂有限公司)。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

2.1.1 对照品溶液称取左旋紫草素对照品2.5 mg于50 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解并定容，即得质量分数为0.05 mg/mL的左旋紫草素对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液称取适量紫草中药饮片，粉碎过3号筛，得紫草粗品，精密称取紫草粉末1.0 g，置于100 mL的烧杯中，加入40 mL橄榄油于40 ℃下浸泡4 h，取上述橄榄油1 mL于10 mL容量瓶中加95%乙醇定容，即得。

2.2 线性关系考察

2.2.1 紫草含量检测波长的选择精密吸取1 mL左旋紫草素对照品溶液和紫草供试品溶液于不同10 mL量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀静置，以无水乙醇为对照，在200～800 nm波长下扫描，以波长为横坐标，吸收值为纵坐标。结果表明，溶液吸光度在516 nm波长处较大，故选择516 nm为检测波长。紫外-可见光谱图见图1。

(a)左旋紫草素对照品

2.2.2 标准曲线的绘制及线性范围考察分别精密移取2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL左旋紫草素对照品溶液，于10 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀静置，以无水乙醇为对照，在波长为516 nm处测定其吸光度。以吸光度为纵坐标(y)、浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线。得到左旋紫草素对照品的回归方程为y=20.96x+0.0292(r2=0.9988)，紫草检测质量浓度线性范围为0.01～0.03 mg/mL。

2.3 新疆紫草中总萘醌的含量测定

精密量取上述样品供试液2 mL，按“2.2.2”项下的操作方法，再计算出样品中总萘醌的量。

2.4 单因素考察实验

2.4.1 料液比对总萘醌得率的影响精密称取1 g紫草粉末，共5份，置锥形瓶中，依次加入10、20、40、60、80 mL的橄榄油，在25℃的条件下，浸泡4 h，每个样品中取1 mL加入10 mL的无水乙醇超声3 min，于3000 r/min离心。由图2可知，随着橄榄油体积的增加，总萘醌得率先上升后下降，当橄榄油的体积为40 mL时，得率最高，故选择料液比20、40、60 g/mL为后续优化参考水平。

图 2 料液比对总萘醌得率的影响

2.4.2 提取时间对总萘醌得率的影响精密称取1 g紫草粉末，共5份，置锥形瓶中，加入20 mL橄榄油，在25 ℃下分别浸泡1、2、4、6、8 h，在每个样品中取1 mL加入10 mL的无水乙醇超声3 min，于3000 r/min离心。由图3可知，浸泡时间在4 h的时候，总萘醌的得率最高，故选择2、4、6 h为后续优化参考水平。

图 3 提取时间总萘醌得率的影响

2.4.3 提取温度对总萘醌得率的影响精密称取1 g紫草粉末，共5份，置锥形瓶中，加入20 mL橄榄油，分别在20、40、60、80、100 ℃下浸泡4 h，在每个样品中取1 mL加入10 mL的无水乙醇超声3 min，于3000 r/min离心。由图4可知，随着提取温度的升高，总萘醌得率先升高后下降，当温度为50 ℃时得率达最高，故40、50、60 ℃为后续优化参考水平。

图 4 提取温度对总萘醌得率的影响

2.5 Box-Behnken设计-响应面法优化试验

2.5.1 方案设计及实验结果根据单因素试验，综合考虑影响紫草总萘醌得率的3个因素，即料液比(A)、提取时间(B)和提取温度(C)，采用Box-Behnken法设计实验方案，做响应面的优化研究。用-1、0、1分别表示因素的低、中、高三个水平，设计3因素3水平的响应面分析实验。实验因素及水平见表1，方案设计及结果见表2。

表1 实验因素及水平

表2 响应面分析实验设计与结果

2.5.2 模型的建立及显著性检验采用Design-Expert.10.0.7软件进行多元回归拟合分析，以紫草总萘醌含量(Y)为响应值对料液比(A)、提取时间(B)、提取温度(C)进行多元线性回归和二次多项式方程拟合，得回归方程为：

Y=2.30+0.047A-0.071B-6.25×

10-3C+0.013AB-0.038AC-0.06BC-

0.17A2-0.09B2-0.28C2

方差分析结果见表3。

表3 方差分析表

由表3可知，该模型的P<0.01，表明该回归模型是显著的，用该模型对紫草中总萘醌的提取工艺进行分析验证是合理的。失拟项P=0.2990>0.05，说明未知因素对试验结果的干扰很小，可以利用该模型确定最佳提取工艺条件。

2.5.3 响应面优化图及分析采用Design-Expert.10.0.7软件进行分析，得出相应的响应面图。由图5三维图可以发现，当料液比在1∶35～1∶45范围内时，总萘醌的得率随温度的升高逐渐下降；等高线图呈椭圆形，说明料液比和提取温度之间的交互作用显著；图6等高线图呈圆形，说明提取时间和料液比之间的交互作用不显著；由图7三维图可以发现，当提取时间一定时，总萘醌的得率随温度升高逐渐下降，等高线图呈椭圆形，说明提取温度和提取时间之间的交互作用显著。因此在合适的料液比、提取温度、提取时间下，紫草中总萘醌的得率会出现极大值。

图 5 料液比和温度响应面图

图 6 料液比和时间的响应曲面图

图 7 时间和温度的响应曲面图

2.5.4 验证实验通过Design-Expert.10.0.7软件对模型求解方程，得到最优提取工艺条件，料液比1∶42.49，提取温度46.05 ℃，提取时间4.04 h，在该条件下总萘醌含量达到最大值2.32%。为便于实际操作，将总萘醌的提取工艺调整如下，料液比1∶42，提取温度46 ℃，提取时间4 h。在此条件下平行进行3次验证试验，得率分别为2.22%、2.31%和2.25%，测得总萘醌平均得率2.26%，与模型预测值2.32%接近，表明该工艺条件稳定、可靠，同时也说明建立的回归模型合理。

3 讨论与结论

本研究采用Box-Behnken响应面法优化紫草中总萘醌的提取工艺。研究表明，随着温度的升高或浸泡时间的延长，紫草中总萘醌得率都呈现先升高后下降的趋势，推测其可能是紫草中蒽醌类结构不稳定导致。有报道称，紫草素具有光不稳定性，萘醌类结构中的羟基也使紫草素易被氧化[9-10]。本研究首次采用橄榄油作为提取溶剂。橄榄油是一种安全的食用油且含有多种天然的生理活性物质，如VE、VK和类胡萝卜素等[11]，在开发一些中药应用产品时具有协同或增效的价值，并且本研究在紫草中总萘醌的提取上，采用橄榄油浸泡提取法，其操作简单，得率较高，具有实际应用价值。

综上所述，本研究采用橄榄油作为溶剂，通过Box-Behnken设计-响应面法成功优化了紫草中总萘醌的提取工艺,优化后的提取工艺合理可行。