小儿宝泰康颗粒对流感病毒感染细胞的抗病毒作用研究

刘军 陈田 汤记路 刘媛媛 杨占秋

摘要 目的：观察小儿宝泰康颗粒对流感病毒感染细胞的抑制作用。方法：通过细胞培养技术观察不同浓度的小儿宝泰康颗粒对Madin-Darby犬腎（MDCK）细胞的细胞毒性作用，采用MTT法并结合CPE法检测细胞成活率和病毒抑制率，计算药物的抗病毒指数TI，以利巴韦林作为阳性对照药物，评价该药物对甲、乙型流感病毒的抗病毒活性。结果：小儿宝泰康颗粒对MDCK细胞的半数细胞毒性浓度（CC50）为5.6 mg/mL，对甲型H1N1流感病毒感染MDCK细胞的半数有效浓度（EC50）为2.1 mg/mL，而对乙型流感病毒的EC50为1.44 mg/mL，抗病毒指数分别为2.64和3.89。在阳性对照药物实验中，利巴韦林在200 μg/mL时，对甲、乙型流感病毒的抑制率均达到70%以上。结论：小儿宝泰康颗粒是一种对不同型流感病毒感染有抗病毒作用的药物，有临床应用前景和进一步研究的价值。

关键词 小儿宝泰康颗粒;流感病毒;MTT法;CPE法;抗病毒指数;细胞实验;病毒抑制率;细胞毒性;半数有效浓度

Study on Antiviral Activity of Xiao′er Baotaikang Granuels Against Influenza Virus in Vitro

LIU Jun1，CHEN Tian2，TANG Jilu1，LIU Yuanyuan 1，YANG Zhanqiu1

（1 Institute of Medical Virology，School of Basic Medicine，Wuhan University，Wuhan 430071，China; 2 Department of Clinical Lab，Hubei Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Wuhan 430015，China）

Abstract Objective：To investigate the antiviral activity of Xiao′er Baotaikang Granuels on influenza virus in vitro.Methods：We observed the cytotoxic effect of different concentrations of Xiaoer Baotaikang Granules on Madin-Darby canine kidney（MDCK） cells by cell culture technology，used MTT method combined with CPE method to detect cell survival rate and virus inhibition rate，calculated the drug′s antiviral index TI，and used ribavirin as positive control drug to evaluate the antiviral activity of the drug against influenza A and B viruses.Results：The 50% cytotoxic concentration （CC50） of Xiaoer Baotaikang Granules on MDCK cells was 5.6 mg/mL，and the 50% effective concentration （EC50） for MDCK cells infected by influenza A H1N1 virus was 2.1 mg/mL，while for influenza B viruses The EC50 was 1.44 mg/mL，and the antiviral indexes were 2.64 and 3.89，respectively.In the positive control drug experiment，when ribavirin was 200 μg/mL，the inhibition rate of influenza A and B viruses reached more than 70%.Conclusion：Xiaoer Baotaikang Granules are a kind of antiviral drugs that have antiviral effects on different types of influenza virus infections.It has clinical application prospects and further research value.

Keywords Xiaoer Baotaikang Granules; Influenza virus; MTT method; Cytopathologic effect assay; Antiviral index; Cell experiment; Inhibition rate;Cytotoxicity; 50% effective concentration

中图分类号：R254.3文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.018

在以发热为主要症状的呼吸道感染疾病中，流感病毒仍是最为常见的致病病原体[1]。由于流感病毒易发生变异，常出现新亚型病毒株传播流行。因此，人类尚不能完全控制流感病毒引起的病毒性传染病，历史上曾数次出现世界性大流行。如2009年底在美国和全球范围内爆发的新型甲型H1N1流感，当时无有效疫苗进行预防和控制其传播而造成大流行;而目前全球每年有近500万人感染流感病毒，其中至少有25～50万人死亡[2-3]。流感病毒（Influenza Virus）属于正粘病毒科（Orthomyxoviridae）成员，根据病毒的宿主类型，分为人流感病毒、禽流感病毒和动物流感病毒。根据病毒的生物学特征，人流感病毒又分为甲（A）、乙（B）和丙（C）型以及近期报道的丁（D）型流感病毒[4]。甲型流感病毒因抗原性易发生变异，血凝素（HA）基因变异最为常见，并出现很多新的亚型，其中以甲型H1N1流感病毒多见[5]。乙型流感病毒仅在人群中局部传播流行，不引起世界性大流行。丙型流感病毒只引起轻微的上呼吸道感染，也很少引起流行[2，6]。由于化学合成药物易出现毒性和耐药性，导致其临床应用受限。如金刚烷胺及其衍生物不仅存在神经毒性，且易产生耐药毒株，对B型流感病毒感染基本无效补充参考文献;利巴韦林治疗流感可出现骨髓毒性，对其疗效争议较多;奥司他韦是WHO推荐治疗甲型H1N1流感病毒感染的药物，但由于其不良反应、耐药株逐年增多，有的国家已限制将其用于青少年流感病毒感染的治疗[7]。因此，需要寻找新的抗流感病毒药物用于临床。

中草药在流感病毒感染的治疗中具有独特优势，诸多文献报道了中药在流感病毒感染中的临床应用及药物抗病毒活性成分的现代研究，如板蓝根冲剂，其具有清热解毒和抗菌消炎等作用[8-9]。近年来也有较多中药抗病毒机制研究的报道，如Yan等[10]报道蓟黄素（Cirsimaritin）有抑制多种甲型流感病毒株的作用，并通过抑制细胞因子的表达而发挥抗病毒作用。鉴于中药在治疗流感病毒感染中的优势，为了寻找更多适用于抗流感病毒且不良反应少、未产生耐药性的药物，我们观察了小儿宝泰康颗粒在细胞培养中对甲、乙型流感病毒的抗病毒作用，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 MDCK细胞为中国科学院武汉病毒所王薇副研究员赠送。

1.1.2 病毒 流感病毒A/FM/1/47（H1N1），由中国预防科学院病毒学研究所提供，乙型流感病毒为本室保存。使用前2种病毒用9～11日龄鸡胚，经过尿囊腔接种增殖病毒，收集尿囊液，以1 500×g离心15 min，收上清液后，用血凝实验检测病毒血凝滴度，当血凝滴度≥1∶640，过滤除菌，分装备用。

1.1.3 药物 小儿宝泰康颗粒（健民药业集团股份有限公司，批号：210341）;阳性对照药物利巴韦林（天津药业有限公司，批号：0203071）。

1.1.4 主要试剂与仪器 细胞生长液为RPMI640（GIBICO公司，美国，批号：12800-017），加10%小牛血清（GIBICO公司，美国，批号;10099-141），100 U/mL青霉素（Invitrogin公司，美国，批号：15070063），100 μg/mL链霉素（Invitrogin公司，美国，批号：15070063）。细胞维持液除新生小牛血清为2%外，其余同细胞生长液。MTT（4，5二甲基噻唑-2，5-二苯基四唑溴化物）（SIGMA公司，日本，批号：57360-96-7）;DMEM（GIBICO公司，美国，批号：12800-017，31330-038）;胎牛血清（GIBICO公司产品，美国，批号：10099-141）;二甲基亚砜（DMSO）（上海菲达有限公司，批号：67-68-5）;Forma Scientific生物安全工作台（Forma公司，美国，型号：1160E型）;OLYMPUS倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本，型号：IMT-413型）;自动酶联免疫检测仪（Rayto公司，美国，型号：RT-2100C型;二氧化碳培养箱（Thermo公司，美国，型号：Series Ⅱ）。

1.2 方法

1.2.1 小儿宝泰康颗粒的配制与实验分组 称取小儿宝泰康颗粒100 mg，加入蒸馏水溶解，定容至10 mL，8磅高压灭菌15 min备用。临用时用细胞维持培养基稀释至所需浓度。阳性对照药物利巴韦林用生理盐水无菌稀释至0.1 g/mL备用。

本实验分2个部分，首先观察小儿宝泰康颗粒的细胞毒性，然后在半数细胞毒性范围内，观察小儿宝泰康颗的抗流感病毒效果。

1.2.2 小儿宝泰康颗粒对Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞的毒性作用观察 用胰蛋白酶将生长良好的MDCK细胞分散成单个细胞悬液，在96孔板上，每孔加入0.1 mL 5×106浓度的MDCK细胞，待24 h细胞长成单层后，加入10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.313 mg/mL、0.156 mg/mL等7个不同浓度的含药维持液，置37 ℃，5% CO2培养箱培养48 h。每一药物浓度均重复4孔，实验重复3次，同时设正常细胞对照。观察药物的细胞毒性。

1.2.3 小儿宝泰康颗的抗流感病毒作用观察 于已长成单层MDCK细胞的96孔培养板上，每孔接种50 μL的100TCID50的流感病毒液，分别于33 ℃吸附90 min，弃病毒上清。根据细胞毒性实验的结果，在小儿宝泰康颗粒半数细胞毒性浓度范围内，加入不同浓度的含小儿宝泰康颗粒的细胞维持液，每孔0.2 mL，浓度分别为5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.312 5 mg/mL、0.156 25 mg/mL、0.078 125 mg/mL，分别置33 ℃，5% CO2培养，每日观察。隔天换新鲜含药维持液。每种浓度重复4孔。同时设正常细胞对照组、病毒对照组、阳性药物对照。实验重复3次。观察药物的抗病毒作用。

1.2.4 小儿宝泰康颗粒对流感病毒感染细胞内HA的抑制作用 按抗流感病毒实验，待流感病毒吸附MDCK细胞90 min后，将不同浓度小儿宝泰康颗粒加入到96孔细胞板内200 μL/孔，置35 ℃ CO2孵箱中培养，72 h后收集各实验孔病毒上清进行血凝实验，检测细胞内HA的表达情况。

1.2.5 小儿宝泰康颗粒的半数细胞毒性（CC50）检测 以细胞成活率作为药物的细胞毒性评价指标。药物作用细胞48 h后，MTT法检测细胞成活率。MTT法参照文献加以改进[11-12]，检测小儿宝泰康颗粒对MDCK细胞毒性作用。上述小儿宝泰康颗粒处理的培养细胞48 h后，弃细胞培养液上清，每孔加入含5 mg/mL MTT的PBS溶液50 μL，置37 ℃，CO2培养箱中继续培养2～3 h后，弃上清，每孔加DMSO溶解液100 μL，振荡5～10 min，待结晶完全溶解，置酶标测定仪上，测定570 nm波长处的光密度OD值，并根据下式计算细胞成活率和药物半数细胞毒性浓度（CC50）。

细胞成活率（%）=药物处理组平均OD570细胞对照组平均OD570×100%

1.2.6 小儿宝泰康颗粒的抗流感病毒效果测定指标与方法 以病毒抑制率和病毒血凝素（HA）抑制率为指标评价药物的抗流感病毒效果，前者以病毒抗原OD值变化为指标，后者以病毒HA抗原变化为指标。参考文献检测小儿宝泰康颗粒对流感病毒的抑制率[12，14]。在上述（1.2.3）药物处理的病毒感染细胞120 h后，每孔加入含5 mg/mL MTT的培養液50 μL，继续培养2～3 h后，洗去MTT上清，加DMSO溶解液每孔100 μL，混匀，5 min后，用酶标仪测570 nm波长处的光密度OD值。并按下述公式计算小儿宝泰康颗粒对流感病毒的抑制率。

病毒抑制率（%）=药物处理组OD570-病毒对照组OD570细胞对照组OD570-病毒对照组OD570×100%

病毒HA檢测参考文献[14]，在上述（1.2.4）药物处理的病毒感染细胞72 h后，用96孔血凝板，除第一孔外，每孔加入25 μL生理盐水。第一孔加50 μL待测病毒悬液，取25 μL做2倍系列稀释，最后一孔弃去25 μL。每孔加入25 μL1%鸡红细胞悬液，使红细胞与病毒充分混合，室温静置30 min，45 min，60 min时，观察血凝现象并记录结果。以静置45 min时的血凝现象为最终结果。以出现“++”（即红细胞在孔底形成一个环状，四周有小凝集块）的流感病毒最高稀释度为血凝终点，该稀释度的倒数即为流感病毒的血凝滴度。实验同时设生理盐水对照（排除血细胞自身的非特异性凝集）和病毒对照。并按下式计算病毒血凝素（HA）抑制率。

病毒HA抑制率=病毒对照组血凝滴度-实验孔血凝滴度病毒对照组血凝滴度×100%

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 17.0进行数据分析，所有数据均以均值±标准误（±s）表示。多组数据间的对比用one-way ANOVA进行分析比较，细胞成活率和病毒抑制率与药物浓度之间的关系用Probit回归进行分析，计算小儿宝泰康颗粒半数毒性浓度（CC50）和半数有效浓度（EC50），得到小儿宝泰康颗粒抗病毒指数（Treatment Index，TI=CC50/EC50）。

2 结果

2.1 小儿宝泰康颗粒对MDCK细胞的半数毒性浓度测定 小儿宝泰康颗粒从10 mg/mL稀释至0.157 mg/mL等7个浓度时，细胞成活率从25.8%提高到97.5%，细胞成活率与药物浓度呈反向梯度关系，未用小儿宝泰康颗粒处理的正常细胞成活率为100%，OD值为0.894。用probit回归统计分析，测得小儿宝泰康颗粒对MDCK细胞的半数细胞毒性浓度（CC50）为5.6 mg/mL。见表1。

2.2 小儿宝泰康颗粒对甲、乙型流感病毒感染细胞的抗病毒作用 在半数细胞毒性浓度范围内，病毒的抑制率与小儿宝泰康颗粒浓度呈正相量效关系，在2.5 mg/mL时，甲型流感病毒的抑制率为62.9%，当浓度低至0.078 mg/mL时，未显示出抗病毒作用。见表2。小儿宝泰康颗粒对甲型流感病毒的EC50为2.12 mg/mL。以2.0 mg/mL稀释至0.063 mg/mL等6个浓度抗病毒活性，呈现出与甲型流感病毒同样的结果。见表3。在2.0 mg/mL时，乙型流感病毒的抑制率达到85%，EC50为1.44 mg/mL。小儿宝泰康颗粒对2种病毒的抗病毒指数分别为2.64和3.89（P<0.05）。病毒HA抗原的抑制率与小儿宝泰康颗粒浓度呈正相量效关系，差异有统计学意义（P<0.05）。在阳性对照药物实验中，利巴韦林浓度为0.2 mg/mL时，对甲、乙型流感病毒的抑制率均达到70%以上。见表2～3。

3 讨论

由于流感病毒感染普遍存在且无有效的预防措施，抗流感病毒等呼吸道病毒感染药物一直是研究热点，诸多新制剂也运用于抗病毒研究[13-14]。这些抗流感病毒制剂有化学合成药物、抗体药物和天然植物药物[15-17]，近年来也有报道称纳米药物可能通过影响病毒进入细胞从而预防流感病毒感染的报道，但尚处于初步研究阶段[18-19]。我们过去也发现阿比朵尔和欧意清热解毒软胶囊有抗甲型H1N1流感病毒作用，并已进入临床应用阶段[20-21]。解秀文和郭春艳[22]也报道小儿宝泰康颗粒治疗小儿急性上呼吸道感染有较好的临床治疗效果，但是否对流感病毒有抗病毒作用尚无定论。

小儿宝泰康颗粒是由连翘、地黄、滇柴胡、玄参和桑叶等12味中药组成的复方中成药制剂，由健民药业集团股份有限公司生产，它具有解表清热、止咳化痰作用，临床上广泛用于小儿风热外感，症见发热、流涕、咳嗽、脉浮等的治疗，效果较好。有报道处方中的连翘、地黄、玄参和南板蓝根具有抗流感病毒作用，小儿宝泰康颗粒对金黄色萄球菌、肺炎球菌等有抗菌作用，但是对流感病毒感染有无抗病毒作用尚未见报道[8，23]。为了确定小儿宝泰康颗粒的抗流感病毒效果，我们利用流感病毒敏感的MDCK细胞株进行体外细胞实验，观察了该药对甲、乙型流感病毒的抗病毒作用。

MDCK细胞（狗肾细胞株）是一种对不同流感病毒敏感的细胞系，能支持不同型流感病毒复制增殖，是体外评价抗流感病毒的模型系统。为此，我们首先观察了小儿宝泰康颗粒对MDCK细胞的细胞毒作用，发现小儿宝泰康颗粒对MDCK细胞的半数细胞毒性浓度为5.6 mg/mL，说明该药细胞毒浓度较高，安全性大。根据病毒进入细胞的复制机制，参考Dou等[23]研究报道，本实验以该药半数细胞毒性浓度为依据，以利巴韦林作为阳性药物对照，观察了小儿宝泰康颗粒6个不同稀释度时在MDCK细胞内的抗流感病毒活性，结果显示小儿宝泰康颗粒对甲、乙型流感病毒感染的MDCK细胞均有抗病毒活性，表现为病毒抑制率和病毒HA抗原抑制率随着药物浓度增加而增加，显示出明显的量效关系。当小儿宝泰康颗粒的半数细胞毒性浓度（TC50）为5.6 mg/mL时，对甲、乙型流感病毒的半数有效浓度分别为2.12 mg/mL和1.44 mg/mL。这些结果证明了小儿宝泰康颗粒在细胞内有抗流感病毒作用且安全性高，同时验证了小儿宝泰康颗粒治疗儿童急性上呼吸道感染有较好治疗效果的结论[22]。

本研究结果也显示小儿宝泰康颗粒对甲、乙型流感病毒的抗病毒指数不同，分别为2.64和3.89，这可能是因为甲型流感病毒易发生变异，变异后病毒的生物学特征发生改变，故对药物的敏感性不同所致。此外，阳性对照药物利巴韦林与小儿宝泰康颗粒显示对病毒的抑制作用浓度亦不同，这是由于利巴韦林为化学合成药物，成分单一，结构清楚，而小儿宝泰康颗粒是由多种中草药组成的复方制剂，药物的显效成分和结构不同，故起效浓度不同，但是以它作为参照证明了小儿宝泰康颗粒的抗流感病毒作用。小儿宝泰康颗粒的抗病毒有效成分和结构特征与抗病毒活性的关系仍有待深入研究。

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（2021-09-05收稿 责任编辑：吴珊）