糖尿病性溃疡动物模型的制备及评价▲

陈壮丽 卢 维 李杰辉

(1 广西中医药大学研究生院，南宁市 530023，电子邮箱：914453972@qq.com；2 广西中医药大学第一附属医院创面修复、周围血管科，南宁市 530023)

【提要】 随着社会经济的发展，糖尿病的患病人数逐年增加，糖尿病性溃疡等相关并发症的发病率也呈上升趋势，严重地威胁居民的健康。糖尿病性溃疡动物模型的制备有利于深入研究糖尿病性溃疡创面的发病机制，为临床诊治疾病提供强有力的科研证据和药物作用机制。本文就糖尿病性溃疡动物模型的研究现状及其进展进行综述。

糖尿病是常见的慢性疾病之一，糖尿病及其相关并发症已经成为威胁我国居民健康的重大问题之一。据统计，2017年全球约有4.51亿人(18～99岁)患有糖尿病，预计到2045年糖尿病患病人数将增至6.93亿[1]。研究显示，大多数糖尿病足是由缺血性、神经病理性或混合性神经缺血性异常引起，是糖尿病常见的严重并发症之一[2]。与正常人的创面相比，糖尿病患者由于长期处于高糖状态，其创面修复细胞(成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞等)发生病变、血管内皮损伤，创面溃疡难愈合且反复难治[3]。随着对糖尿病性溃疡发病机制研究的逐步深入，其治疗手段也取得很大进步，如抗感染、负压引流、高压氧疗、生长因子、分子生物学和组织工程技术、中医中药等对糖尿病性溃疡均有一定的疗效。实验研究可为疾病的治疗提供科研证据，因此，糖尿病溃疡动物模型的建立对研究糖尿病性溃疡具有一定意义。本研究主要阐述糖尿病性溃疡动物模型的制备及其研究近况。

1 糖尿病动物模型的构建方法

目前，大多数研究选择鼠类作为糖尿病动物模型，构建方法主要有链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)注射诱导法或者STZ注射结合高糖高脂饲料喂养法，或者直接选择自发性动物模型、转基因糖尿病动物模型(基因敲除糖尿病动物模型)。但对于造模过程中的血糖检测标准、检测时间和STZ剂量问题，目前尚无统一标准。

1.1 STZ诱导法 化学药物在诱导实验性糖尿病动物模型中得到广泛应用，由于STZ具有毒性小、稳定性好、成模速度快等优点而被广泛使用，其药物可通过激活机体自身免疫选择性，导致胰岛B细胞坏死、胰岛素缺乏，使血糖升高或者产生针对胰岛B细胞的自身抗体，诱导糖尿病的发生。有研究显示，多次小剂量(50 mg/kg)STZ腹腔注射较单次大剂量(150 mg/kg)注射能更有效地建立糖尿病小鼠模型[4]。多次腹腔注射STZ(60 mg/kg或70 mg/kg)诱导小鼠成模率高且血糖水平稳定，可持续损伤胰岛细胞，导致机体自身免疫系统紊乱，与临床上Ⅰ型糖尿病的发病机制相似[5-6]。

1.2 高脂饮食结合STZ诱导法 本法先通过高脂饮食使鼠类产生胰岛素抵抗，之后腹腔注射STZ破坏胰岛细胞，研究显示，该方法可提高成模率、模型稳定性及变异性，目前应用较为广泛。例如，陈欣等[7]采用高脂高糖饲料喂养SD大鼠一段时间(1个月)后，连续给予小剂量STZ(25 mg/kg)腹腔注射2 d，结果显示该法可以构建稳定的Ⅱ型糖尿病动物模型[7]。李友山等[8]采用高脂高糖饲料喂养雄性SD大鼠(80～100 g)1个月后，单次腹腔注射 STZ 40 mg/kg，可构造较为可靠的糖尿病大鼠模型。此研究在糖尿病大鼠模型基础上，人为创建溃疡创面，动态观察创面愈合过程。此造模方法可以观察到糖尿病性溃疡创面的组织病理学特点，为研究糖尿病性溃疡创面的机制和治疗提供思路。以上文献提示高糖高脂饮食喂养1～2个月左右，可诱发大鼠胰岛素抵抗，同时联合STZ注射可诱导胰岛细胞损伤从而构建糖尿病大鼠模型[9]，但不同的STZ给药剂量，糖尿病的病情会有所差异[10]，但不可否认的是该方法可获得较稳定的糖尿病动物模型。

1.3 自发性糖尿病动物模型 自发性糖尿病动物模型是动物自然发生糖尿病，或通过遗传培育保留的糖尿病模型，该模型与人类Ⅱ型糖尿病的临床症状相似，常用于建立模型的动物有db/db小鼠、ob/ob小鼠、KK-AY小鼠、GK大鼠等[11]。db/db小鼠是模拟人类Ⅱ型糖尿病模型的良好动物，此小鼠变异程度高，具有稳定的高血糖、胰岛素抵抗和血脂异常等状态，适用于临床上对糖尿病及其相关并发症的研究[12-13]。池骏等[14]通过敲除瘦素基因建立糖尿病小鼠模型，该小鼠模型具有自发性、高重复性和稳定的Ⅱ型糖尿病症状表型等特点，瘦素基因敲除小鼠与ob/ob小鼠较相似，为糖尿病相关疾病的研究提供了重要的造模条件，但瘦素基因缺陷导致的糖尿病在临床上极为少见，与患者发病机制存在一定差异。KK-AY小鼠是KK小鼠通过转入黄色肥胖基因而形成的一种糖尿病动物模型，此小鼠可用于建立多种糖尿病并发症模型，如糖尿病肾病模型、肝损害模型等，但由于其对饲养条件的要求较高，在实验研究中的应用有一定局限性[15]。GK鼠类糖尿病动物模型具有稳定的葡萄糖耐受和胰岛素抵抗，适用于构建非肥胖糖尿病动物模型，相比于高脂饮食联合STZ诱导建立的糖尿病动物模型来说，GK大鼠模型具有更好的遗传稳定性，更适合应用于Ⅱ型糖尿病发病机制的研究[16]。总的来说，在关于糖尿病性溃疡创面的研究中，db/db小鼠、ob/ob小鼠糖尿病模型是较常见的动物模型。但由于自发性糖尿病动物模型的价格昂贵且不易获得、对饲养条件要求过高，故而较少应用于科研实验中。

1.4 基因工程动物模型 基因工程动物模型(基因敲除糖尿病动物模型)是运用DNA靶向修饰技术，通过基因敲除或修饰改变相关糖代谢基因的表达，导致糖代谢紊乱，从而建立相关动物模型，如相关位点胰岛素受体底物1、2基因的敲除。除此之外，还可以通过敲除相关基因，如Unc13基因、PDHA1基因等，建立糖尿病动物模型并应用于糖尿病疾病及相关并发症的实验研究中[17-18]。但转基因工程技术的操作和制备难度较大，价格昂贵且不易获取，因而在一般的实验研究中难以广泛开展应用。

2 模拟病理因素的糖尿病性溃疡动物模型及其分类

实验性糖尿病动物从患病到形成溃疡所需时间较长，因此，一般采用人为模拟病理因素的方法来建立糖尿病性溃疡模型，主要分为缺血性动物溃疡模型、神经病变性动物溃疡模型、感染性动物溃疡模型。

2.1 缺血性动物溃疡模型

2.1.1 血管结扎法：下肢血管病变缺血是导致糖尿病足溃疡的重要原因之一，基于此机制可以采用下肢血管结扎、离断血管的方法建立下肢缺血性溃疡模型。有学者采用腹腔注射STZ诱导糖尿病小鼠模型后，采用高位结扎股动脉、股静脉并断离股动脉的方法建立下肢缺血模型，并结合激光多普勒成像仪监测血流变化，结果显示，该方法建立的糖尿病溃疡模型可进行定量分析，可信度高[19]。但该模型通过下肢血管高位结扎和/或离断下肢血管形成的急性缺血坏死病理改变，可能与临床上由糖尿病引起的中、小及微血管慢性缺血病变导致的糖尿病性溃疡有较大差异。高怀林等[20]采用高脂饮食+STZ诱导糖尿病大鼠后，对大鼠股动脉及股静脉进行离断，成功建立糖尿病足模型，并将其用于糖尿病足大鼠血管内皮功能研究中。但此模型通过离断股动脉及股静脉建立的糖尿病足病变，与临床上糖尿病患者由于长期高血糖状态导致血管病变甚至缺血，或同时伴有侧支血管损伤的病理有一定差异。

2.1.2 皮肤压迫法：有学者先腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型后，再利用磁片磁铁相互吸引压迫的方法诱导局部组织皮肤缺血-再灌注损伤而形成糖尿病大鼠溃疡模型(将磁片植入大鼠背部，再通过外部磁铁相互吸引产生压力，从而造成皮肤局部缺血)，但由于实验过程未进行实时、客观地监测血流，无法直接说明压迫部位缺血-再灌注的过程；并且单一皮肤压迫法诱导缺血形成的溃疡与长期糖尿病导致的慢性缺血病理改变存在很大的差异[21-23]。

2.2 神经性病变动物模型 屈璐等[24]采用高脂饮食+STZ诱导SD大鼠糖尿病模型后，沿大鼠坐骨神经解剖位置放置干冻袋，12周后检测大鼠坐骨神经动作电位传导速度并观察坐骨神经病理形态学，如出现坐骨神经功能减退及病理形态改变即认为糖尿病周围神经病变的大鼠模型构建成功。但在科研实验中，较少单独建立动物神经性病变溃疡模型。

2.3 感染性动物模型 感染是糖尿病性溃疡常见的并发症之一。在感染致病菌中，革兰阴性菌和革兰阳性菌所占比例均等，但常见单菌致病菌为金黄色葡萄球菌[25]。目前糖尿病感染性动物模型的建立一般都采用皮下菌株注射。有学者采用STZ+高脂饮食诱导建立大鼠糖尿病模型后，使用恒温恒压烫伤仪烫伤大鼠背部下端皮肤(参数：温度90℃，压力9.8 N，探头4 cm2，接触时间10 s)，同时皮下注射质控菌株以形成溃疡感染，构建多因素诱导的糖尿病性溃疡模型，结果显示该模型可更为真实地模拟临床上糖尿病性溃疡创面的发病机制及多因素下创面溃疡感染的疾病特征[26-27]。

3 模拟临床症状体征的糖尿病性溃疡动物模型及其分类

模拟临床症状体征的糖尿病性溃疡动物模型主要分为皮肤全层切除模型、烫伤模型等。

3.1 皮肤全层切除模型 腹腔注射STZ诱导糖尿病动物模型后，应用外科方法，用18 mm的圆形图章在距肩胛骨水平下2 cm脊柱正中皮肤上(造模区)印出标志，消毒后沿标志剪去全层皮肤(深至筋膜)，制备皮肤缺损创面[28-30]。此方法可操作性强、耗时短，溃疡形态规则且面积可控，适合外用辅料及药物，以及糖尿病性溃疡创面的相关研究。但该模型无法模拟糖尿病患者因长期高血糖状况下导致机体血管、神经、免疫功能等方面发生病理改变从而引发溃疡创面的过程；同时溃疡创面持续时间较短，若进行长周期的糖尿病性溃疡创面研究，可运用多因素联合造模的方法来延长溃疡持续时间，如联合皮下菌株注射合并感染[31]。

3.2 烫伤模型 糖尿病周围神经病变导致肢体末端感觉、温度觉下降或缺失后，糖尿病患者对温度感觉也随之减弱，因此烫伤成为糖尿病性溃疡的常见因素之一。有研究应用高脂饮食+腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,并于4周后将大鼠股动脉及其分支结扎24 h，使用烫伤模具建造体表烫伤模型，病理结果显示大鼠皮肤创面组织炎症细胞浸润，伴随汗腺、毛囊等附件破坏，形成深Ⅱ度烫伤，该实验应用血管结扎结合烫伤因素造模，更好地模拟了糖尿病性溃疡创面形成的过程[32]。

4 总结与展望

高糖高脂饮食结合STZ诱导法是目前常用的糖尿病动物模型建模方法，皮肤全层切除法是常用的糖尿病性溃疡动物模型建模方法。但这些方法仍存在以下问题：(1)对造模动物血糖的检测标准、血糖检测时间、STZ造模所用剂量等，目前尚无统一标准；(2)造模中急性缺血性坏死的病理改变与糖尿病溃疡创面中的慢性缺血性病理改变有一定差异；(3)局部压迫法中缺少可实时、客观监测的血流指标；(4)单独模拟病理因素或单一模拟临床症状体征，不能完全模拟多种致病机制，使得动物模型的病因症状及病理机制与临床上的糖尿病性溃疡仍存在较大差距。

单独模拟病理因素或临床症状体征建立糖尿病性溃疡动物模型相对简易、耗时较短，其中模拟病理因素的动物模型更符合糖尿病性溃疡的发病机制[33]。但临床上糖尿病性溃疡主要是由血管损伤、神经病变所致，加上溃疡创面容易反复感染,在实验造模上很难完全模拟溃疡创面发生的全过程。实验研究中可以通过多因素联合作用来制备糖尿病溃疡动物模型，使造模动物的发病特点及病理机制等与临床糖尿病性溃疡创面更为接近。