注射用神经节苷脂钠对癫痫持续状态大鼠认知功能障碍及神经炎症的改善作用及机制▲

欧诒丹 陈 静 高元杰

(海南省儋州市人民医院神经内科，儋州市 571700，电子邮箱：flower1988@163.com)

癫痫是一种由大脑神经元异常过度放电引起的反复发作的神经系统疾病[1]。癫痫发作持续30 min以上，或在短时间内频繁发作而不能自止的状态，称为癫痫持续状态[2]。若癫痫持续时间过长或多次反复发作，可造成不可逆的脑损伤，导致患者认知功能障碍[3]。丙戊酸钠、卡马西平和苯妥英钠等是目前临床常用的抗癫痫药物，但仍有20%～30%的癫痫患者经治疗后还会频繁发作并发展为难治性癫痫[4]。同时，常规抗癫痫药物伴存在多种不良反应，这些不良反应也影响了患者服药的依从性。因此，寻找疗效较好且副作用小的抗癫痫药物成为当前迫切需要解决的问题。神经节苷脂钠注射液为治疗中枢神经系统损伤性疾病的常用药，癫痫持续状态是造成患者神经损伤的主要病因，神经节苷脂钠能够穿透血脑屏障，有效促进神经功能恢复[5-7]。近年来，大量研究显示癫痫发作引起的神经炎症反应是导致脑组织病理改变以及认知功能损伤的重要原因[8-10]。Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)-髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)信号通路在癫痫发生和发展过程中发挥着重要作用[9]，深入研究其与神经炎症及癫痫发作的关系，有利于进一步阐明癫痫发病的机制。本研究主要分析注射用神经节苷脂钠对氯化锂-毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态大鼠认知功能障碍及神经炎症的改善作用并基于TLR4-MyD88通路探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验药物及试剂 单唾液酸四己糖神经节苷脂钠注射液(20 mg/支)购自北京赛升药业股份有限公司(批号：20193881)；丙戊酸钠片(500 mg/片)购自山东仁和堂药业有限公司(批号：20200427)；氯化锂(100 g/瓶)购自国药集团化学试剂有限公司(批号：310468)；盐酸毛果芸香碱(5 g/瓶)购自上海迈瑞尔化学技术有限公司(批号：1538901CAS)；溴甲基东莨菪碱(25 mg/瓶)购自上海禾丰制药有限公司产品(批号：190213)；地西泮(2 mL/10 mg)购自上海旭东海普药业有限公司(批号：190301)。Nissl染色试剂盒购自上海生工生物工程有限公司(批号：1922S04)；白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)的酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自上海酶科(批号：20200125、20200311、20200214)；总蛋白提取试剂盒购自Sigma公司(批号：017K6145)，TLR-4抗体、核因子κB (nuclear factor κB，NF-κB)抗体、MyD88抗体、β-肌动蛋白抗体购自R&D公司(批号：220645、223712、220428、220635)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗购自Abcam公司(批号：ab205811)。

1.2 主要仪器 WMT-100水迷宫视频跟踪分析系统(成都泰盟软件有限公司)；RM 2235石蜡切片机(Leica公司);ChemTron KSW 光学显微镜(Leica公司)；RT-6500型酶标仪(深圳雷杜公司)；-80℃超低温冰箱(SANYO公司)；电泳仪、凝胶成像仪(Bio-Rad公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验动物及分组：无特定病原体级雄性SD大鼠60只，体重(200±20) g，6～8周龄。大鼠购自海南药物研究所有限责任公司[动物许可证号:SYXK(琼)2020-0007]，饲养于20℃～25℃、相对湿度为50%～65%的环境中，实验前适应性饲养1周。称大鼠体重后，将不同体重的大鼠采用随机区组方法分为空白组、模型组、阳性对照组、神经节苷脂钠组，每组15只。

1.3.2 模型制备：采用腹腔注射氯化锂-毛果芸香碱建立癫痫大鼠模型[10]。取模型组、阳性对照组及神经节苷脂钠组大鼠，均先给予氯化锂(127 mg/kg)腹腔注射，18～20 h后给予毛果芸香碱(30 mg/kg)腹腔注射，注射毛果芸香碱前30 min给予溴甲基东莨菪碱(1 mg/kg)腹腔注射以减轻胆碱能外周反应。注射毛果芸香碱后立即观察各组大鼠的行为表现，根据Racine分级标准[11]判定大鼠是否出现癫痫发作。其中，正常状态为0级；面部肌肉抽动痉挛为Ⅰ级；Ⅰ级+颈部肌肉痉挛为Ⅱ级；Ⅱ级+前肢痉挛为Ⅲ级；Ⅲ级+后肢站立为Ⅳ级；Ⅳ级+身体向后跌倒、四肢抽动为Ⅴ级。若癫痫未发作或发作未达到Ⅳ级，则每隔30 min腹腔注射毛果芸香碱一次(10 mg/kg)，直至出现癫痫持续状态。癫痫发作达到Ⅳ～Ⅴ级并持续达30 min者为造模成功。发作持续1 h后腹腔注射地西泮(10 mg/kg)以终止发作。空白组给予腹腔注射等容量生理盐水。

1.3.3 给药方式：造模成功后第1天，给予空白组、模型组及神经节苷脂钠组大鼠经腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，将大鼠固定于ZS-B型大鼠立体定位仪，切开头皮，暴露颅骨,以右侧海马CA3 中心区为注射靶点，用微量注射器给予神经节苷脂钠组大鼠注射神经节苷脂钠注射液20 μL，每隔10 d注射1次，连续注射3次；空白组、模型组于同时间注入等容量无菌生理盐水，完成注射后留针5 min，退针后缝合头皮。阳性对照组给予丙戊酸钠(400 mg/kg)腹腔注射，3次/d，连续30 d。

1.4 观察指标

1.4.1 Morris水迷宫实验：(1)定位航行实验。采用WMT-100型水迷宫进行实验。于给药第40天开始对各组大鼠进行训练及测试。将大鼠面朝池壁，随机从不同的4个象限入水点入水1次，每天训练4次，共训练5 d。记录90 s内大鼠自入水至爬上平台所需时间，即逃避潜伏期。若入水后90 s内未找到平台，或未爬上平台，则将大鼠放置于平台站立10 s后休息30～60 s，再进行下一次训练。记录各组大鼠逃避潜伏期和游泳总距离。(2)空间探索实验。于水迷宫实验第6天进行空间探索实验，检测各组大鼠对原平台的记忆能力。撤除平台后，将大鼠从平台对侧象限的中点放入水中，记录大鼠在90 s内穿越平台的次数、游泳总距离及在原平台象限的探索时间。

1.4.2 血清IL-1β、IL6、TNF-α含量检测：给药第45天，水迷宫实验结束后，给予大鼠腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉，解剖大鼠后经腹主动脉采血2 mL，3 000 r/min离心15 min取血清，分装置于-20℃保存待测。严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平。方法为从-20℃冰箱取出血清，常温下放置1 h后，3 000 r/min离心15 min后取上清液检测。样品孔加入待检样品10 μL，依次加入样品稀释剂40 μL，相应抗体100 μL，置于37℃孵育1 h，用试剂盒配套洗涤液洗涤5次。每孔加入底物液A、B各50 μL显色，37℃避光孵育15 min。各反应孔加入终止液50 μL，于酶标仪450 nm下检测各孔吸光度值。

1.4.3 Nissl染色观察海马结构的形态学变化：实验结束后，腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg)麻醉大鼠并采集血标本后，采用随机数字表法分别于各组随机选取7只大鼠，开胸暴露心脏，用生理盐水(4℃)冲洗血液，再灌注含4%多聚甲醛的磷酸缓冲盐溶液，灌注1 h后立即剥离脑组织，置于4%多聚甲醛溶液中4℃固定72 h，将脑组织经冠状面均匀切成3段，取中间含海马段脑组织行石蜡包埋，做5 μm厚连续冠状切片，取石蜡切片进行Nissl染色，于光学显微镜下观察大鼠海马CA3区神经元的形态学改变。

1.4.4 海马组织中TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表达水平的检测：实验结束后，取各组其余8只大鼠，同法麻醉后剥离脑组织获取大鼠海马组织，采用免疫印迹试验法检测大鼠海马组织中TLR-4、NF-κB p65、MyD88的蛋白表达水平。取大鼠海马组织100～200 mg，提取总蛋白，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度，制作十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶，上样后行电泳，电泳结束后将蛋白转印至硝酸纤维膜，采用含5%脱脂牛奶的封闭液室温封闭硝酸纤维膜2 h，一抗(1 ∶1 000)4℃孵育过夜，TBST洗膜；二抗(1 ∶5 000)37℃孵育1 h，TBST洗膜，于暗室用发光液孵育膜后，在凝胶成像系统中曝光，采用Image J 软件分析各条带灰度值，以β-肌动蛋白为内参，计算目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值。

1.5 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。计量资料以(x±s)表示，多组样本间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 神经节苷脂钠对癫痫大鼠定位航行能力的影响 水迷宫实验期间，与空白组大鼠相比，其他3组大鼠第1～5天的逃避潜伏期均延长；与模型组相比，阳性对照组及神经节苷脂钠组大鼠逃避潜伏期时间均缩短(均P<0.05)，但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。与空白组相比，其他3组大鼠实验游泳总距离均增加；与模型组相比，阳性对照组、神经节苷脂钠组大鼠游泳总距离缩短(均P<0.05)，但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表1 各组大鼠逃避潜伏期的比较(x±s，s)

表2 各组大鼠游泳总距离的比较(x±s，cm)

2.2 神经节苷脂钠对癫痫大鼠空间探索能力的影响 水迷宫实验期间，与空白组大鼠相比，其他3组大鼠在原平台象限探索有效时间比率及游泳距离比率降低，穿越原平台次数减少(均P<0.05)。与模型组比较，阳性对照组及神经节苷脂钠组大鼠在原平台象限探索有效时间及游泳距离比率升高，穿越原平台次数增多(均P<0.05)，但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠原平台象限探索有效时间比率、游泳距离比率、穿越平台次数的比较(x±s)

2.3 神经节苷脂钠对癫痫大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影响 与空白组大鼠比较，其他3组大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6的含量升高(均P<0.05)；与模型组相比，阳性对照组、神经节苷脂钠组IL-1β、TNF-α、IL-6含量降低(均P<0.05)；与阳性对照组相比，神经节苷脂钠组血清TNF-α含量降低(P<0.05)，但两组IL-1β、IL-6差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6的含量比较(x±s，ng/mL)

2.4 神经节苷脂钠对大鼠海马组织神经元形态的影响 Nissl染色可见，空白组大鼠海马CA3 区神经细胞密度高，排列整齐，尼氏体染色均匀，尼氏小体丰富。模型组大鼠海马CA3 区可见神经元损伤，细胞核固缩，细胞间隙扩张，结构紊乱，尼氏体出现凝集，数量减少。阳性对照组、神经节苷脂钠组大鼠的海马CA3 区异常神经元数量减少，细胞排列比较规律，尼氏体数量较模型组有所增加，神经细胞变性程度较模型组减轻。见图1。

图1 各组大鼠海马组织神经元形态(Nissl染色，×400)

2.5 神经节苷脂钠对大鼠海马组织TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表达水平的影响 与空白组相比，其他3组大鼠海马组织TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白相对表达水平升高(均P<0.05)；与模型组比较，阳性对照组及神经节苷脂钠组大鼠海马组织TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表达水平均降低(均P<0.05)，但两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图2和表5。

图2 各组TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表达情况

表5 各组大鼠海马组织中TLR-4-MyD88通路相关蛋白相对表达水平的比较(x±s)

3 讨 论

癫痫是一种常见的慢性神经系统疾病，是由多种原因引起的脑内神经元反复异常放电，以反复不自主发作为主要临床特点[1]。经抗癫痫药物治疗后，目前有70%～80%的癫痫患者癫痫发作得到有效控制，但仍有20%～30%的患者治疗效果不理想[4]，且临床常规的抗癫痫药物也存在头晕、嗜睡、行为改变等多种不良反应。因此，寻找疗效较好且毒副作用小的抗癫痫药物具有重要的临床意义。

神经节苷脂是一类从猪脑中提取的具有神经保护作用的生物制剂，常用于脑出血、脑梗死、脊髓损伤及颅脑损伤性疾病的治疗[12]。单唾液酸神经节苷脂钠，即神经节苷脂钠，是哺乳动物脑组织中神经节苷脂的主要种类。其能够穿透血脑屏障，修复各种原因引起的中枢神经系统损伤，因而成为药理学及临床研究的热点[5]。临床研究表明，神经节苷脂钠注射液能够有效减轻癫痫患者的症状，并能减少常规抗癫痫药物引起的并发症，在癫痫的治疗上具有良好的应用价值。例如，李小战[13]的临床研究显示，在常规抗癫痫药物的基础上应用神经节苷脂钠注射液能够更有效控制癫痫发作，改善患者临床症状，对脑外伤癫痫患者疗效良好。此外，有研究显示，神经节苷脂钠还能够有效减少癫痫患者常规抗癫痫治疗相关不良反应的发生[14]。以上研究结果提示，神经节苷脂钠在癫痫的治疗中具有较大的潜力。但目前关于神经节苷脂钠抗癫痫作用的机制如何，研究报告较少。

氯化锂-毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态大鼠模型主要表现为癫痫反复发作及海马组织病理学改变，被认为是目前最理想的癫痫动物模型[10]。因此，本研究采用氯化锂-毛果芸香碱诱导癫痫持续状态大鼠模型，探讨神经节苷脂钠侧脑室注射对癫痫大鼠认知功能和神经炎症的作用及其机制。癫痫持续状态反复发生可引起中枢神经系统损伤，继而导致不同程度的认知功能障碍，主要包括记忆力减退、学习能力及智力水平下降等改变[15]。现普遍认为位于大脑丘脑和内侧颞叶之间的海马在人的记忆功能中起着重要作用，在认知障碍者中常可见到该区域的病理变化[16]。海马皮质可划分为CA1、CA2、CA3、CA4四个部分，其中CAl和CA3与学习、记忆以及认知功能相关。研究表明，癫痫持续状态可引起海马CAl及CA3区神经元损伤，并引起海马组织病理性改变[17]。本研究结果显示，模型组大鼠水迷宫实验的逃避潜伏期延长，游泳距离增加，在原平台象限探索有效时间比率及游泳距离比率降低，穿越原平台次数减少，表明模型组大鼠出现学习记忆能力下降及随意运动障碍。癫痫模型病理改变为海马神经元的丢失，海马区可见存活神经元和尼氏体含量的减少，通过Nissl染色可观察神经元的受损程度，本研究的Nissl染色显示，模型组大鼠海马CA3 区可见神经元损伤，细胞核固缩，细胞间隙扩张，结构紊乱，尼氏体出现凝集，数量减少，提示模型建立成功。经侧脑室注射神经节苷脂钠后，与模型组比较，大鼠在水迷宫实验过程中逃避潜伏期及游泳距离缩短，找到平台时间缩短，穿越原平台次数增加，且神经元损伤情况减轻，提示神经节苷脂钠能够减轻氯化锂-毛果芸香碱所致的癫痫持续状态大鼠的认知功能障碍和神经元损伤。

尽管癫痫所致认知障碍的机制还不十分明确，但许多学者认为神经炎症反应与其发生和发展密切相关。癫痫发作后能够促使局部炎性因子分泌，进而迅速引起脑组织炎症反应，这种现象称为“神经炎症”[18]。研究表明，神经炎症反应能够引起神经元损伤，促使海马区域炎症反应放大并分泌大量炎性因子，从而导致认知功能障碍[19]。有研究显示，在癫痫动物模型及癫痫患者脑组织中，IL-1β、 IL-6及TNF-α等促炎性细胞因子表达水平均升高，提示癫痫发病可能与炎症反应有关[20]。本研究结果显示，模型组大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6的含量升高，提示癫痫大鼠体内存在炎症反应；而与模型组相比，阳性对照组、神经节苷脂钠组IL-1β、TNF-α、IL-6含量降低(均P<0.05)，提示神经节苷脂钠能够减轻神经炎症，从而改善大鼠的认知功能障碍。

TLR-4-MyD88信号通路与癫痫的发生和发展密切相关。TLR-4主要表达于脑组织的星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元，可以与脂多糖、IL-1等炎症因子结合，进一步激活下游信号分子[21]。Maroso等[22]研究发现，癫痫小鼠海马组织中TLR-4的表达增多，经TLR-4特异性拮抗剂处理后，小鼠癫痫症状明显减轻。NF-κB p65位于TLR通路的下游，与TNF-α、IL-6等多种促炎细胞因子的表达密切相关，是炎症过程中炎症介质的重要调节因子[23]。MyD88是TLR-4介导信号通路的关键蛋白，能够促使 NF-κB p65由胞质转移到胞核，从而发挥转录调控作用；其还可以上调 IL-1β、TNF-α等炎症因子的表达，导致炎性级联反应，从而加快癫痫的进展[24]。本研究结果显示，与空白组相比，模型组大鼠海马组织TLR-4、NF-κB p65、MyD88蛋白表达水平升高；与模型组比较，阳性对照组及神经节苷脂钠组大鼠海马组织TLR4、NF-κB p65、MyD88蛋白表达水平均降低(均P<0.05)。这提示神经节苷脂钠能够有效降低大鼠海马组织中TLR-4、NF-κB p65、MyD88的蛋白表达以减轻神经炎症，从而发挥保护神经功能的作用。

综上所述，神经节苷脂钠能够减轻氯化锂-毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态大鼠的神经炎症，并改善大鼠认知功能障碍，其作用机制可能与抑制TLR4-MyD88信号通路的激活有关。