鱼腥草发酵工艺条件的优化研究

陈佩瑶，姜立春，胡榆琳，赵秋月

（绵阳师范学院，四川绵阳 621000）

鱼腥草（英文名：Herba Houttuyniae）是三白草科植物蕺菜属植物蕺菜（拉丁学名：Houttuynia cordataThunb.）的干燥地上部分及新鲜全草[1]。药理试验表明，鱼腥草具有抗菌[2]、抗炎[3-6]、抗过敏、镇痛和止血等功效。从鱼腥草中提取出的黄酮能清除体内自由基，被用来治疗心血管疾病。

本试验旨在通过利用单因素及响应面分析，探究料液比、接种量、发酵时间及发酵温度对鱼腥草发酵提取总黄酮得率的影响，为提高鱼腥草发酵液中黄酮含量提供新的研究方向和思路，以期为鱼腥草发酵产业的发展提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

鱼腥草（购于绵阳永兴康贝大药房）。

1.2 试剂

酵母菌（安琪酵母股份有限公司）、果胶酶（和氏璧生物科技有限公司）、蛋白酶（和氏璧生物科技有限公司）、纤维素酶（和氏璧生物科技有限公司）、芦丁（上海如吉生物科技对照品专用）、蛋白胨（OXOID LTD）、酵母浸粉（OXOID LTD）等。

1.3 仪器设备

DZTW型电热套、LKTC-B1型水浴锅、SC-3610型低速离心机、MS-3020型自控高压消毒锅、BCD-216E/B型低温冰箱、SW-CJ-1FD型超净工作台、DHP-600型电热恒温干燥培养箱

1.4 试验方法

1.4.1 鱼腥草发酵工艺

将鱼腥草茎段切成1 cm小段，浸泡于蒸馏水中，漂洗3次后沥干，40 ℃烘箱中干燥至恒重后粉碎2次，5 min/次，过40目筛。根据一定料液比配制成鱼腥草悬浮液，在40 ℃水浴温度下浸提3 h，浸提后加入50 ℃水浴锅中用一定的酶进行酶解3 h，将酶解后的鱼腥草溶液调pH至4左右，105 ℃，灭菌30 min。冷却后的鱼腥草溶液接种一定量的活化酵母，在一定培养温度下，恒温培养一定时间，发酵结束取滤液待测。

1.4.2 黄酮标准曲线的制作

卢丁标准溶液。于100 mL容量瓶中加入10 mg芦丁对照品、10 mL甲醇，待对照品溶解后，用蒸馏水定容，摇匀，制成0.1 mg/mL的卢丁标准溶液。利用可见分光光度计，波长510 nm处测定吸光值。以葡萄糖标准溶液浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标进行线性回归，得到标准曲线方程为：y=0.790 4x，R2=0.992 1。根据R2=0.992 1可知，黄酮标准曲线的线性关系良好。

1.4.3 单因素试验

单因素试验考察了料液比、接种量、发酵时间、发酵温度和酶解时酶种类5个因素对黄酮提取率的影响。料液比分别为1∶12、1∶16、1∶20、1∶24和1∶28，酵母菌接种量分别为0.5%、1%、2%、4%和6%，发酵时间分别为3 d、5 d、7 d、9 d和11 d，发酵温度分别为23 ℃、26 ℃、29 ℃、32 ℃和35 ℃，酶解时酶种类分别为果胶酶、果胶酶+蛋白酶、果胶酶+纤维素酶和果胶酶+纤维素酶+蛋白酶。

1.4.4 分析方法

（1）总黄酮含量的测定。采用紫外分光光度法测定样品中的总黄酮含量[7]。

（2）数据分析。采用Excel2019和Design-Expert8.0.6Trial软件进行数据统计及分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对鱼腥草发酵结果的影响

根据1.4.1方法，分析料液比对鱼腥草发酵结果的影响，结果如图1所示。随着料液比的增加，黄酮含量先升高后下降，在料液比为1∶24时，黄酮含量达到峰值，黄酮含量为0.091 mg/mL，此时发酵效果最好。

图1 料液比对鱼腥草发酵结果的影响

2.1.2 接种量对鱼腥草发酵结果的影响

根据1.4.1方法，分析接种量对鱼腥草发酵结果的影响，结果如图2所示。随着酵母菌接种量的增加，总黄酮含量先缓慢增加，再缓慢减少，最终趋于平稳；当酵母菌接种量为4%时，总黄酮含量最高，为0.08 mg/mL。

图2 菌种接种量对鱼腥草发酵结果的影响

2.1.3 发酵时间对鱼腥草发酵结果的影响

根据1.4.1方法，分析发酵时间对鱼腥草发酵结果的影响，结果如图3所示。随着发酵时间的增加，黄酮含量先缓慢增加后缓慢减少。当培养天数为7 d时，总黄酮含量达到峰值，为0.091 mg/mL。

图3 发酵时间对鱼腥草发酵结果的影响

2.1.4 发酵温度对鱼腥草发酵结果的影响

根据1.4.1方法，分析发酵温度对鱼腥草发酵结果的影响，结果如图4所示。随着发酵温度的升高，总黄酮含量先缓慢增加后缓慢减少。当发酵温度为29 ℃时，总黄酮含量最高，为0.086 mg/mL。

图4 发酵温度对鱼腥草发酵结果的影响

2.1.5 酶解菌种对鱼腥草发酵结果的影响

根据1.4.1方法，分析酶解菌种对鱼腥草发酵结果的影响，结果如图5所示（A为果胶酶，B为蛋白酶，C为纤维素酶）。当酶种为A+B+C时，总黄酮含量达到峰值，为0.082 mg/mL。

图5 酶解种类不同对鱼腥草发酵结果的影响

2.2 响应面试验设计及最优条件的确定[8-9]

根据单因素试验结果，利用响应面对鱼腥草发酵条件进一步优化，分别选取A料液比、B接种量、C发酵时间、D发酵温度，设计4因素3水平的响应面试验，以总黄酮得率作为考察指标，试验设计及结果如表1所示。

表1 响应面试验设计及结果

利用软件对试验数据进行分析得到以黄酮为响应值的回归 线 方 程 为：Y=0.089+3.250×10-3×A+3.147×10-3×B+3.500×10-3×C+3.000×10-3×D+7.500×10-4×AB+7.500×10-4×AC+1.750×10-3×AD-1.250×10-3×BC+2.500×10-3×BD+5.000×10-4×CD-8.683×10-3×A2-6.433×10-3×B2-9.808×10-3×C2-7.558×10-3×D2（R2=0.941 0，P＜ 0.000 1）。

由表2可知，回归方程的P＜0.000 1，说明该回归方程模拟效果极显著，失拟项P=0.376 5＞0.05，说明失拟项检验不显著，回归方程模型拟合度高，试验误差对试验结果干扰性较低。R2=0.941 0，说明响应面的理论值和实际值呈较为显著的相关性。此外，模型A、B、C、D对黄酮得率的影响极显著（P＜0.01）。从F值的大小可以看出，发酵条件的4个因素对鱼腥草发酵的影响大小为：C发酵时间＞B接种量＞A料液比＞D发酵温度。

表2 回归模型方差分析

利用Design-Expert软件绘制料液比、接种量、发酵时间以及发酵温度4个因素之间的交互作用对总黄酮得率的响应面，结果如图6所示。

图6反映了料液比、接种量、发酵时间、发酵温度4个因素之间两两交互作用对黄酮提取率的影响。从响应曲面图中可以看出，各个因素在试验设定的参数范围内都存在最高点，说明试验设定参数合理。结合表2可以得出，AB、AC、AD、BC、BD、CD两两交互作用对黄酮得率影响不显著（P＞ 0.05）。

图6 各因素对发酵样品中黄酮得率影响的响应曲面图

2.3 黄酮最优提取条件验证试验

综合响应面结果分析出的鱼腥草发酵总黄酮得率最优条件为料液比为1∶24.47；接种量为6.31%；发酵时间为7.18 d；发酵温度为29.56 ℃，此时鱼腥草发酵黄酮含量值为0.091 mg/mL。为验证试验结果的真实性，且从实际情况出发，将鱼腥草的发酵工艺参数调整为：料液比为1∶25；接种量为6%；发酵时间为7 d；发酵温度为30 ℃，在此试验条件下进行3次验证试验，得出黄酮提取率平均值为（0.095±0.004） mg/mL，与响应面分析得到的预测值基本符合，因此该响应面模型优化的黄酮提取率可靠性较高。

3 结论

本研究以鱼腥草为原料，以黄酮含量作为试验指标，选取料液比、接种量、发酵时间和发酵温度作为影响因子，利用单因素试验探究对鱼腥草发酵产黄酮的影响，再利用响应面分析影响因子之间的交互作用及最佳发酵工艺条件，研究结果表明：影响作用：发酵时间＞接种量＞料液比＞发酵温度；发酵优化条件为料液比1∶25，接种量6%，发酵时间7 d，发酵温度30 ℃，在此条件下，鱼腥草发酵提取到的黄酮得率的平均值为（0.095±0.004） mg/mL，说明响应面模型可靠性高。