月饼中菌落总数不确定度评定

常玉梅，杨彩英，杨 萌，薛香菊，吕 艳

（山东药品食品职业学院，山东威海 264210）

食品微生物检验对评价食品卫生质量、监督食品安全有着尤为重要的作用，其结果的准确性影响结果报告的判定。菌落总数定义为食品样品经过处理，在合理的培养条件下培养后，每克或每毫升食品检样中所生长出来的的微生物菌落总数[1]。菌落总数是评价食品污染程度、储存期以及安全性的卫生指示菌[2]。《检测和校准实验室能力认可准则》（ISO/IEC 17025：2017）中明确指出实验室应具备对测量结果进行不确定度评定的能力[3]。《检测和校准实验室能力认可准则在微生物检测领域的应用说明》（CNAS-CL01-A001）也指出在微生物检测中需要对不确定度做出合理评估[4]。不确定度评定是评定结果可靠性的有效方法。研究按照《测量不确定度的要求》（CNAS-CL01-G003）[5]和 JJF1059.1—2012[6]、GB/T 27418—2017[7]对微生物检验中菌落总数的检测结果作不确定度评定。对菌落总数测定结果进行不确定度评定是质量控制的一部分，对于数据的可靠性、结果的符合性判定具有重要意义[8]。

1 材料与检测方法

1.1 测试样品

本测量不确定度评定实例为单一样品的重复测量，测试样品为月饼。《月饼》（GB/T 19855—2015）[9]对菌落总数做出的要求为符合《食品安全国家标准 糕点、面包》（GB 7099—2015）[10]，最高限量为104CFU/g，所以实验稀释度取10-1与10-2。

1.2 材料与设备

平板计数琼脂（250 g，青岛海博生物技术有限公司）；B级洁净实验室；高压蒸汽灭菌器（MSL.N，山东威高集团）；净化工作台（SJ-CJ-2FD，苏州苏洁）；生化培养箱（SPX-250B-Z，上海博讯）。

1.3 实验方法

1.3.1 检测依据

《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）[1]。

1.3.2 检测过程

（1）无菌操作称取25 g月饼于均质袋中，加入225 mL生理盐水进行均质，转速8 000～10 000 r/min，时间2 min，制成10-1样品匀液。

（2）吸取1 mL上述样品匀液，沿试管壁加入1支无菌试管中（含9 mL生理盐水），充分混匀，制成10-2样品匀液。

（3）稀释时在无菌平皿内加入1 mL样品匀液（2个平行），同时用无菌生理盐水做空白对照。

（4）每皿倾注20 mL平板计数琼脂培养基（46 ℃左右），转动平皿，使培养基与样液混合均匀。

（5）平板凝固后，倒置培养，温度（36±1）℃，时间（48±2）h。

（6）结果观察并计算。菌落计数范围30～300 CFU/g。

2 数学模型

（1）只有一个稀释度（10-3）的菌落在可计数范围，则，，例d=10-3。

（2）2个连续稀释度（如10-2、10-3）的菌落在可计数范围，则为：

式中：N检样中菌落总数，CFU/g；∑C平板菌落总数的和，CFU/g；n1低稀释倍数平板个数；n2高稀释倍数平板个数；d-稀释因子（第一稀释度），例d=10-2。

3 不确定度的评定

菌落总数检测的特点是数据结果的发散性很大，不是正态分布，而属于偏态分布，因此直接通过结果平均值的计算，得到标准偏差的方法显得不太合理[11]。所以通常的做法是将结果取对数后，再用常规的贝塞尔方法进行计算[12-13]。

不确定度测量除各种系统因素的影响外，还包括随机因素的影响[14]。微生物检测不确定度一般来源于培养基、培养条件、计量器具校准及操作人员技能等[15]。本研究对B类不确定度（样品处理、稀释、加样体积）及A类不确定度（重复操作）进行分析，见表1。

表1 不确定度汇总表

3.1 标准不确定度估算

3.1.1 样品处理相对标准不确定度（urel（制备））

制备10-1样品匀液，主要涉及称取样品时电子秤（使用1次）的相对标准不确定度和量取生理盐水时量筒（使用1次）的相对标准不确定度。

根据天平制造商的说明书，该天平的分辨力d=0.1 g，区间半宽度为0.05 g，按矩形分布，按照样品称量取25.0 g；根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006）[16]得知250 mL量筒容量允许误差为±2.0 mL，取矩形分布[17]。则样品称量引入的相对标准不确定度分量为：

3.1.2 递增稀释相对标准不确定度（urel（稀释））

在制备样品匀液时，主要由1 mL和10 mL移液器引入的不确定度，1 000 μL和10 000 μL移液器的容量允许误差[18]分别为 ±10 μL 和 ±60 μL，其中10 mL和1 mL移液器各用了1次。

3.1.3 加样体积相对标准不确定度（urel（加样））

吸取1 mL样品匀液于无菌平皿内，做2个平行，使用1 000 μL移液器2次。加样时相对标准不确定度为：

3.1.4 A类重复测量引起的不确定度（urel（A））

按照试验方法对样品平行测定10次，检测数据见表2。具体计算如下。

表2 单一样品重复测量的计算过程

（1）每次测量结果均值xi。

（2）取对数lgxi，计算平均值

（4）数据结果为10次重复操作的平均值，则为：

3.2 相对合成标准不确定度及扩展不确定度

引起不确定度分量都是相对独立的，则合成不确定度为：

依据标准《化学分析测量不确定度评定 》（JJF 1135—2005）[19]， 由 于 置 信 概率p=95%，自由度v=10-1=9，由t分布表可得

3.3 取反对数，由lgx坐标回到x坐标

由于lgx与x的非线性关系，不能直接求扩展不确定度U的反对数[20]，只能给出微生物含量的可能区间。因此确定lgx的取值范围为：lgx=3.542 3±0.149 2，即lgx的取值为3.393 1～3.691 5，再取反对数后可得2.5×103CFU/g≤x≤4.9×103CFU/g。

4 仅A类重复测量引起的不确定度

在评定不确定度时，不考虑B类各种随机影响引入的不确定度分量。10次重复测量的平均值的标准不确定度为：

由于置信概率p=95%，自由度v=10-1=9，由t分布表可得k=2。于是为：

u95=2urel(A)=0.148 4

5 结论

从不确定度计算结果可以看出，4种因素对测量结果均有影响，经计算得出，这些分量可以忽略不计。B类不确定度分量对合成不确定度影响较小，A类重复测量带来的不确定度分量最大，所以主要考虑重复操作引起的不确定度，即统计的A类评定测量不确定度是可行的。按照此方法进行菌落总数的不确定度评定，可减少误差，提高结果精确度，对测量指标合格与否提供理论依据和指导。