FPS-ZM1和mNGF对癫痫幼鼠脑内HMGB1和TRX表达的影响

李冬梅， 陈巧彬， 陈 琅， 方 琼

癫痫(epilepsy，EP)是神经元异常同步放电引起的慢性脑功能障碍，以反复发作性抽搐为临床特征，可伴有各种并发症和后遗症。尽快终止EP发作，对于保护大脑功能以及减少后续损害尤为重要，明确其发病机制也有利于进行对因治疗。越来越多的研究表明，神经系统免疫炎症反应、氧化应激损伤与EP的发生、发展密不可分[1-2]，晚期糖基化终末产物(receptor for adcanced glycation end products，RAGE)和神经生长因子(nerve growth factor，NGF)及其介导的信号转导通路与EP的关系亦不断有文献报道[3-4]。本研究采用戊四氮点燃大鼠幼崽建立EP模型，并用RAGE抑制剂FPS-ZM1和鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor，mNGF)干预致痫幼鼠，研究慢性点燃EP幼鼠神经损伤的程度，探讨两种药物可能的神经保护机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级Wistar雄性大鼠130只，21～28日龄，体质量50～60 g[许可证号：SCXK(沪)2017-0005,上海斯莱克实验动物有限责任公司]。

1.1.2 试剂 戊四氮(MKCC1690，美国Sigma公司)；mNGF(20160311，中国未名生物医药有限公司)；FPS-ZM1(2908726，美国Meck Millipore公司)；ELISA试剂盒(S20180318MY，上海朗顿生物科技有限公司)；全蛋白抽提试剂盒(KGP250)、Western-blot检测试剂盒(KGP1201)和显影定影试剂(KGP116)(江苏凯基生物科技发展有限公司)。

1.1.3 仪器 电泳仪(Power Supplies Basic)和Trans-Blot Turbo全能型蛋白转印系统(170-4150)(美国Bio-Rad公司)；凝胶成像系统(G：BOXChemiXR5，英国SYNGENE公司)；台式恒温振荡器(HY-4，江苏金坛市正基仪器厂)；涡旋振荡器(XW-80A，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；高速冷冻离心机(Sorvall ST 16R，美国Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立动物模型 幼鼠适应性饲养1周，自由摄食、摄水，室温22 ℃，湿度60%～70%，明暗各12 h照明。大鼠按体质量由大到小依次编号，利用随机数字表法进行排序，依次分为A组(空白对照组)、B组(EP对照组)、C组(mNGF干预组)和D组(FPS-ZM1干预组)。A组31只，每日腹腔注射等剂量生理盐水；其余3组每组33只，每日腹腔注射戊四氮40 mg/kg[5]。EP的发作分级按照Racine分级法[6]，若幼鼠连续发生5次Ⅱ级以上发作判断为慢性点燃。点燃成功后，B～D组戊四氮腹腔注射改为每2～3天进行1次。2周后，A组和B组腹腔注射等剂量生理盐水，C组腹腔注射4 μg/kg的mNGF[7]，D组腹腔注射1 mg/kg的FPS-ZM1[8]，共持续7 d。

1.2.2 测量幼鼠体质量 每日8：00-10：00用电子称量仪(精确至0.1 g)称取各组幼鼠的体质量并记录，观察给药前后的行为学(有无异常活动、惊厥发作形式和持续时间)，记录30 min。

1.2.3 取材 4组幼鼠干预完成后(共3周)，分别于3、24、72 h时段以2%戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉，断头取出全脑，放置于冰盒上，采用高温高压消毒刀片及眼科镊处理全脑组织，分离出海马，放入冻存管内，迅速置入液氮中保存，备用。

1.2.4 检测海马区高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1, HMGB1)和硫氧还蛋白(thioredoxin, TRX)的表达。

1.2.4.1 采用Western-blot法检测HMGB1蛋白表达水平 提取组织蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，经聚丙烯酰胺琼脂凝胶电泳后，转移至PDVF膜，封闭液封闭。用一抗稀释液孵育，4 ℃过夜，TBST洗膜3次。用5%脱脂奶粉封闭液稀释羊抗兔HRP-IgG，室温孵育1～2 h，用TBST洗膜3次，取出PDVF膜，置于配置的ECL工作液中，成像后采用Gel-Pro32软件对数据进行灰度分析，以HMGB1和β-actin的灰度值比值为目的蛋白的表达水平。

1.2.4.2 采用ELISA法测定TRX蛋白的表达水平 按照试剂盒说明书进行操作。

2 结 果

2.1 行为学改变 A组幼鼠正常活动，无异常行为，无死亡。B～D组幼鼠腹腔注射戊四氮后出现Ⅱ～Ⅴ级痫性发作，如湿狗样颤动、咀嚼、节律性点头、前肢阵挛、后肢站立、四肢抽搐及全身强直阵挛。2周后，幼鼠被慢性点燃，其中11只死于惊厥大发作，存活的大鼠重新编号，利用随机数字表法于各时段抽取处死的大鼠。剔除取材过程中失误和不满意的标本，最终各个时段每组均取得9个样本。

2.2 HMGB1蛋白的表达水平 B组海马中各时段的HMGB1蛋白表达量均较A组明显升高，差别有统计学意义(P<0.01)；A组各时段的蛋白表达量差别无统计学意义(P>0.05)；B组各时段的蛋白表达量均高于C组和D组，差别有统计学意义(P<0.01)；D组在3、24 h时段的蛋白表达量较C组低，差别有统计学意义(P<0.05)，在72 h时段较C组略有升高，但差别无统计学意义(P>0.05)。具体见图1及表1。

EP：癫痫；mNGF:鼠神经生长因子;HMGB1:高迁移率族蛋白B1。A组：空白对照组；B组：EP对照组；C组：mNGF干预组：D组：FPS-ZM1干预组。图1 不同时段海马区HMGB1蛋白表达水平Fig.1 HMGB1 protein expression levels in hippocampus at different times

2.3 TRX蛋白的表达水平 B组各时段的TRX含量均较A组降低，差别有统计学意义(P<0.05)；A组各时段的TRX含量差别均无统计学意义(P>0.05)；C组和D组各时段的TRX含量均较B组高，差别有统计学意义(P<0.05)；C组和D组各时段的TRX含量差别均无统计学意义(P>0.05，表2)。

3 讨 论

临床中75%～80% EP起源于儿童时期，且常用的抗EP药物对1/3的患儿疗效不佳。儿童处于生长发育的重要时期，反复发作的EP易造成大脑损伤。因此，探讨EP发作后脑损伤标志物的研究以及采用何种药物进行干预以减轻脑损伤是目前国内外研究的热点。

表1 不同时段海马区HMGB1蛋白表达水平比较

表2 不同时段海马区TRX含量比较

FPS-ZM1是一种高亲和力的新型RAGE受体抑制剂，可透过血脑屏障，对动物模型无毒性作用[9]，即使治疗剂量的500倍亦属安全范围。RAGE广泛表达于细胞表面，与相应配体结合后可启动相应的信号通路，从而激活细胞内氧化应激损伤和免疫炎症反应，进而引起一系列疾病。mNGF是从小鼠颌下腺提纯的活性蛋白，可降低炎症反应，改善过氧化反应，减轻神经元的损伤，已成功应用于治疗脑卒中和脑出血等神经系统疾病[10]。

本研究结果显示，戊四氮致痫幼鼠海马中HMGB1蛋白表达水平在3个时段均明显高于空白对照组。采用FPS-ZM1及mNGF干预后，HMGB1的表达在病程的早期阶段即显著下降，在3和24 h时段，FPS-ZM1干预组的HMGB1表达明显低于mNGF干预组，但72 h时段二者的表达差别无统计学意义。HMGB1是一种炎性因子，同时也是一种促炎细胞因子，与炎症反应密切相关。既往研究认为，HMGB1在中枢神经系统内通常不表达或者表达量很少。但近来动物实验和临床资料均表明，EP个体中HMGB1的表达明显增高[11]。本研究提示，在EP幼鼠病程的早期阶段，FPS-ZM1减轻免疫炎症的作用较mNGF更为显著，随着时间的推移，二者降低炎症反应的效果趋于一致。FPS-ZM1可通过抑制RAGE的表达，进而中断其后续的信号通路及病理改变。有学者通过移植瘤体相关细胞实验证实，FPS-ZM1可通过抑制RAGE受体的活性，进而降低HMGB1的表达[12]。本实验进一步从EP的动物模型验证了FPS-ZM1干预后HMGB1表达下降，从而减轻机体的炎症反应，减轻EP大鼠的脑损伤，且在病程初期就可发挥较好的作用。mNGF的抗炎作用很大程度取决于其与体内相应的受体结合后所产生的生物学效应。

TRX是一类高度保守、多功能、广泛表达的小分子蛋白质，可催化多种氧化还原反应，在神经系统疾病的发展和神经元的保护中发挥作用。当体内氧化应激失调时，其表达反而受到抑制。本研究发现，戊四氮致痫幼鼠海马组织中的TRX含量均低于空白对照组，TRX的含量在应用FPS-ZM1和mNGF干预后均较EP对照组升高，但二者各时段的表达差别均无统计学意义。表明在EP幼鼠的病程早期，二者改善氧化应激损伤的效果相近。FPS-ZM1可通过抑制RAGE减少TRX内源性抑制剂的表达，从而使TRX的表达增多，进而发挥抗氧化应激作用。既往研究推测，mNGF可通过和体内受体结合产生的级联反应发挥抗氧化作用。在临床上mNGF对EP的作用尚存争议，但其抗氧化、抗炎作用仍值得肯定，后续将进一步研究以明确其临床疗效。

本研究验证了免疫炎症、氧化应激参与EP的发病过程。FPS-ZM1和mNGF具有减轻EP幼鼠脑损伤的作用，其机制可能是通过减轻大脑炎症反应和氧化应激来实现的。