厚藤提取物对胶原诱导关节炎模型大鼠的治疗作用研究*

2021-02-12韦棪婷郝二伟夏中尚蒋秋燕杜正彩邓家刚侯小涛

广西科学 2021年6期

韦棪婷，郝二伟，夏中尚,3，蒋秋燕，杜正彩，邓家刚，侯小涛**

(1.广西中医药大学药学院，广西南宁 530200；2.广西中医药大学，广西中药药效研究重点实验室，广西南宁 530200；3.成都中医药大学药学院，四川成都 611137)

0 引言

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种慢性、系统性、自身免疫性炎症疾病，主要攻击滑膜关节，进而导致关节破坏、关节畸形和功能丧失等障碍疾病，这是造成劳动力丧失和残疾的主要原因，严重危害人类健康[1,2]。在我国，RA总患病率为0.32%-0.36%[3]。目前临床上常用于类风湿性关节炎的药物为非甾体抗炎、甾体激素等[4]，均存在诸多不良反应。RA在中医属“痹证”范畴，其病由人体正气不足、脏腑功能失调、风湿寒热燥等外邪入侵，痰瘀气滞，气血运行不畅所引起[5]。中医药具有疗效好、依赖性低、副作用少等优点，利用其治疗RA疾病已成为研究热点[6]。

厚藤(Ipomoeapes-caprae)为旋花科(Convolvulaceae)番薯属(Ipomoea)植物，是我国常用海洋中药材，具有祛风除湿、消痈散结、拔毒消肿的功效，在民间应用广泛。现代药理研究报道，厚藤具有抗炎、免疫调节、抗氧化等功效[7]。目前，厚藤抗RA作用的研究报道较少，本文探讨厚藤提取物(Ipomoeapes-capraeExtract,IPE)对Ⅱ型胶原诱导关节炎(Collagen-induced Arthritis,CIA)模型大鼠的治疗作用，为临床应用及产品开发提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠，6周龄，体质量160-200 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SCXK (湘) 2019-0004。动物饲养于温度(23±2)℃、湿度50%-60%、12 h/12 h昼夜交替光照的环境中，自由进食饮水。动物实验经广西中医药大学动物伦理委员会批准(批准号DW20190418-015)。

1.1.2 药材

厚藤采自广西防城港市北仑河口国家级自然保护区，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为旋花科植物厚藤(Ipomoeapes-caprae(L.)Sweet)的全草。

1.1.3 药品及试剂

牛Ⅱ型胶原(CⅡ,美国Chondrex，批号：190578)，弗氏不完全佐剂(IFA,美国Chondrex，批号：190572)，弗氏完全佐剂(CFA,美国Chondrex，批号：190447)，雷公藤多苷(江苏美通制药公司，批号：200401)，PGE2 ELISA Kit (Bioswamp生物科技有限公司，批号：RA20013)，RF ELISA Kit (上海酶联生物科技有限公司，批号：ml525301)，CRP ELISA Kit (上海酶联生物科技有限公司，批号：ml038253)。

1.1.4 仪器

CPA225D万分之一天平(德国赛多利斯科学仪器北京公司)，HDM-500型恒温电热套(江苏天由发展有限公司)，Hei-VAP型旋转蒸发仪(德国Heidolph公司)，TGL-16M型台式高速冷冻离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)，M200PRO型酶标仪[帝肯(上海)贸易有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 厚藤提取物的制备

称取厚藤全草2.5 kg，切成约10 cm粗段，加水提取2次，第1次加12倍量水，第2次加10倍量水，煮沸后再煎30 min，用200目纱布过滤，合并药液，55℃减压浓缩至稠膏，取提取物稠膏，稀释至相应灌胃浓度进行实验。

1.2.2 动物分组、模型复制及给药

60只大鼠经适应性喂养5 d后，按体质量随机选取8只作为空白组，其余52只大鼠用于复制模型。造模时，将牛Ⅱ型胶原(CⅡ)溶液与等体积弗氏完全佐剂(CFA)混合乳化后，除空白组外，其余组大鼠取背部脊柱两侧和尾根部皮内注射配置好的胶原乳剂0.1 mL，共0.3 mL。初次免疫第7 d，将CⅡ溶液与等体积弗氏不完全佐剂(IFA)混合乳化后，在大鼠右侧踝关节皮下注射0.1 mL进行第2次免疫。空白对照组于相同部位注射等量生理盐水。造模24 d后，挑选造模成功(关节炎指数AI≥3)的大鼠，根据炎症指数随机分为5组，即模型组，阳性组，厚藤提取物高、中、低剂量组，每组8只。

厚藤提取物高、中、低剂量组分别按2.271 2，1.135 6，0.567 8 g/kg鼠重(分别相当于人每日服生药材120，60，30 g)灌胃，阳性对照组按9 mg/kg鼠重给予雷公藤多苷混悬液(加蒸馏水配制成0.6 mg/mL雷公藤多苷混悬液)灌胃，空白组和模型对照组给予等体积的纯化水，每次灌胃容量按1.5 mL/100 g鼠重给予。每日1次，连续21 d。

1.2.3 大鼠情况观察

自给药起，每日观察并记录大鼠活动情况、精神状况、皮毛光泽度、大小便等变化。

1.2.4 踝关节肿胀度测定

造模前，在每只大鼠踝关节测量处用马克笔进行画线标记，确保每次测量位置一致。经2次免疫后，每3 d采用2-3 mm宽纸条和透明软尺，固定测量大鼠右后足踝关节0.5 mm处的关节周径。踝关节肿胀度=(致炎后关节周径-致炎前初始周径)/致炎前初始周径。

1.2.5 足跖肿胀度测定

大鼠经2次免疫后，每3 d用数显游标卡尺测量大鼠右后足跖厚度，足趾肿胀度=(致炎后足跖厚度-致炎前足跖厚度)/致炎前足跖厚度。

1.2.6 关节炎症指数评价

根据关节炎症评分与计数的标准[8](表1)，对大鼠进行关节炎指数评分(总分为四足评分之和)。

表1 关节炎指数评分标准

1.2.7 血清中PGE2、RF、CRP含量测定

末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h。采集血液标本前，用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g鼠重腹腔注射使各组大鼠麻醉，腹主动脉取血，室温放置2 h，3 000 r/min离心10 min，吸出血清，于-80℃低温冰箱保存待测。采用ELISA试剂盒按照说明书检测各组大鼠血清中前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)、类风湿因子(Rheumatoid Factor,RF)、C-反应蛋白(C-reaction Protein,CRP)表达情况。

1.2.8 滑膜组织病理分析

腹主动脉取血后，截取大鼠的踝关节，剔除表面皮肤和肌肉，置于4%多聚甲醛溶液中固定3 d后，换入新的固定液继续固定4 d，将踝关节用PBS清洗3次，继而用纯化水清洗3次，将踝关节转移至20倍体积的脱钙液中脱钙，脱钙液每周更换1次，4-6周时用针刺、钳夹的方法检查脱钙情况，待针刺无阻力感时终止脱钙，将组织脱水、石蜡包埋、切片，经切片脱蜡后进行HE染色。

1.2.9 数据处理

2 结果与分析

2.1 大鼠后肢肿胀情况观察

大鼠后肢踝关节肿胀情况如图1所示。空白组(图1a)大鼠活动自如，无关节炎症现象，毛发顺滑光亮，饮食、大小便正常。模型组(图1b)大鼠踝关节肿胀严重，以右后足踝关节肿胀最为明显，行动迟缓，毛发枯萎且色泽暗淡，精神逐渐萎靡，进食减少。给予厚藤提取物干预后，大鼠踝关节肿胀程度得到减轻。

图1 各组大鼠后肢肿胀情况

2.2 厚藤提取物对CIA大鼠踝关节肿胀度的影响

由表2可知，各组造模大鼠踝关节肿胀度与空白组相比均显著提高(P<0.01)。各治疗组与模型组相比均无显著性差异(P>0.05)，其中，厚藤提取物高剂量组有减轻踝关节肿胀度的趋势。厚藤提取物高、中、低剂量组与阳性组比较，无统计学意义(P>0.05)。

表2 厚藤提取物对CIA大鼠踝关节肿胀度的影响

2.3 厚藤提取物对CIA大鼠足跖肿胀度的影响

厚藤提取物对CIA大鼠足跖肿胀度的影响结果如表3所示。与空白组相比，各组造模大鼠足跖肿胀度均显著提高(P<0.01)。与模型组相比，厚藤提取物各治疗组在给药18 d后，随着给药浓度的升高，足跖肿胀度有逐渐下降的趋势，但各组间无显著性差异(P>0.05)。厚藤提取物各组与阳性组比较，均无显著性差异(P>0.05)。

表3 厚藤提取物对CIA大鼠足跖肿胀度的影响

2.4 厚藤提取物对CIA大鼠关节炎症指数的影响

由图2可知，与空白组相比，各组造模大鼠关节炎指数显著升高(P<0.01)。与模型组相比，阳性组、厚藤提取物高剂量组在给药15 d后关节炎症指数降低(P<0.05)，厚藤提取物中剂量组在给药18 d后关节炎症指数降低(P<0.05)。与阳性组相比，厚藤提取物各治疗组均无统计学意义(P>0.05)。

与空白组比较##P<0.01；与模型组比较*P<0.05

2.5 厚藤提取物对CIA大鼠血清中PGE2、RF、CRP表达的影响

由表4可知，模型组大鼠与空白组相比，血清中PGE2、RF、CRP水平均显著升高(P<0.01)。与模型组相比，各给药组能显著降低RF水平(P<0.01)；除厚藤提取物低剂量组外，厚藤提取物高、中剂量组能显著降低PGE2、CRP水平(P<0.05，P<0.01)。与阳性组相比，厚藤提取物低剂量组血清中PGE2含量明显升高(P<0.05)，厚藤提取物各组RF含量均显著升高(P<0.01)，而CRP含量无显著性差异(P>0.05)。

表4 厚藤提取物对CIA大鼠血清中PGE2、RF、CRP表达的影响

2.6 厚藤提取物对CIA大鼠滑膜组织病理变化的影响

大鼠踝关节病理切片结果如图3所示。光学显微镜下，空白组踝关节组织软骨结构完整，骨层清晰，关节面光滑，软骨细胞分布均匀，软骨内无血管和神经，骨小梁较宽，骨髓腔中细胞分布密集、无空旷区；滑膜结构清晰完整，衬里层由单层或双层滑膜细胞组成，排列疏松且部分不连续，滑膜组织无炎性细胞浸润及纤维组织增生。模型组软骨和软骨下层骨组织受侵蚀，见局部软骨细胞严重减少，部分软骨细胞坏死，见软骨细胞着色较深，胞质溶解，排列紊乱，软骨层及软骨下层骨组织形成纤维裂隙，裂隙间大量毛细血管增生形成血管翳，较多炎性细胞浸润，见核呈圆形深染的淋巴细胞和核呈杆状或分叶状的中性粒细胞，骨组织中见大量的纤维组织填充，可见核呈长椭圆形的成纤维细胞增生。与模型组相比，厚藤提取物低剂量组踝关节组织病变程度相差不大，厚藤提取物中剂量组踝关节组织病变程度相对有所减轻，阳性组和厚藤提取物高剂量组踝关节组织病变程度得到明显减轻。

图3 厚藤提取物对CIA大鼠踝关节病理切片的影响

3 讨论

厚藤作为一种常用海洋中药，现代研究表明，厚藤中含有树脂糖苷类、黄酮类、酚酸类等成分，具有抗炎、镇痛、免疫调节、抗肿瘤等多种药理活性[7]。本课题组前期研究发现，厚藤水提物具有抗急性痛风性关节炎(Acute Gouty Arthris,AGA)作用[9]，AGA与RA都属于风湿病，归属于中医“痹证、痹病”等范畴，本研究旨在探讨厚藤提取物对CIA大鼠的治疗作用。

CIA大鼠关节肿胀和炎症指数评价是反映病程的主要指标，进而评定药物的治疗效果。实验结果表明，与模型组相比，厚藤提取物各治疗组的踝关节肿胀度、足跖肿胀度有减轻的趋势但无显著性差异(P>0.05)，厚藤提取物高、中剂量组可降低CIA大鼠关节炎症评分指数。在实验过程中，造模大鼠发病时间、病情程度不一。首次免疫时将CⅡ和CFA混合乳化后，在大鼠背部两侧及尾根部3点皮内注射，造成大鼠后期出现不同肿胀情况，部分大鼠两后足均出现肿胀现象，个别大鼠出现前肢肿胀；第2次免疫时，选择大鼠右后足进行注射免疫。因此，在实验期间造模大鼠普遍为右后足严重肿胀，其余足不同程度肿胀。在给药前，按炎症评分指数(大鼠四足评分之和)分层随机分组，踝关节肿胀度、足跖肿胀度测量部位为大鼠右后足；给药后，大鼠右后足肿胀消退缓慢，而继发性肿胀消退较快。与模型组比较，厚藤提取物各治疗组大鼠炎症指数评分明显降低，而踝关节肿胀度、足跖肿胀度降低但无显著性差异(P>0.05)。

RA病情发生与多种细胞因子密切相关。在RA模型中，PGE2发挥着关键作用，炎性因子PGE2可以增强单核细胞和中性粒细胞的趋化性，刺激淋巴细胞的增殖和细胞因子的释放[10]，PGE2过度表达可使血管舒张，微循环通透性增加，加重渗出与水肿，诱导软骨破坏，从而加重RA炎症反应[11,12]。RF作为一种特异性抗体，由RA产生，RF表达升高，可加重患者器官功能的损伤[13]。CRP最早在肺炎球菌感染病人中发现，属于急性期蛋白，在发生炎症、组织损失时，表达水平迅速上升，在临床上常被用作诊断炎性反应、免疫防御功能的标志物[14,15]。RF和CRP与RA疾病发展密切相关，可作为诊断和判定RA严重程度的指标[16，17]。