基于网络药理学的蒲黄对血瘀证的作用靶点与代谢通路研究*

黄晓霞，赵唯君，吴相亲，王凯洋，曾 露，王红刚，梁生旺，罗 兰

(广东药科大学中药学院，广东广州 510006)

0 引言

血瘀证是由瘀血内阻引起的病症，是中医证候研究领域的热点[1]。现代医学认为，血瘀证主要表现在血流动力学、血液流变学、血栓、微循环障碍、血管内皮损伤、炎症等方面，会导致各组织器官水肿、炎症渗出、血栓形成、组织变性、结缔组织增生等病理变化，是临床上常见的证候之一[2-4]。有研究表明，蒲黄(Pollentyphae)对血瘀证具有比较明确的治疗作用，如孔祥鹏等[5]通过对血瘀模型大鼠的研究，认为蒲黄可改变异常的血液流变学，降低纤维蛋白原含量从而起到化瘀的作用；刘鹏和周军[6]认为蒲黄可以改变局部血液循环，促进血管及纤维组织增生；杨梓超等[7]研究发现,蒲黄提取物可以下调糖尿病视网膜病变中的炎症水平；过鑫昌等[8]通过临床双盲实验研究证实蒲黄能影响血脂，降低血清总胆固醇含量，降低血小板黏附率，从而影响血小板功能，对血管内皮细胞具有修复作用并抑制粥样斑块的形成。目前，作为活血化瘀药，蒲黄对血液流变学指标有改善作用[9]，且可改善糖尿病大鼠血液中炎症因子的水平[10]，对急性血瘀大鼠的药代动力学作用明显[11]，但其发挥治疗作用的可能药效物质基础及作用机制尚不明确。

蒲黄主要含有黄酮类、甾体、有机酸、烷烃、挥发油、多糖等化学物质[12]，具有止血、化瘀、通淋等功效。蒲黄总黄酮可显著改善急性血瘀证家兔的血液流变学，并抑制血小板聚集[13]；Wang等[14]研究表明，蒲黄总黄酮是活血化瘀的主要活性成分。蒲黄黄酮类成分槲皮素、异鼠李素、柚皮素等均可抑制血小板聚集[15-17]；花生四烯酸在体内被迅速代谢，其代谢物参与细胞免疫及炎症反应[18]；山奈酚可抑制炎症因子，具有抗炎作用[19]。上述研究成果揭示以上化合物可能是治疗血瘀证的主要活性成分。

网络药理学(Network pharmacology)基于在线的数据库、平台和作图软件等，依据中药多成分、多靶点、多途径的整体研究思路，通过数据挖掘、分析以及数据可视化等阐明药物的分子作用机制网络。前期本实验课题组采用LC-MS方法对蒲黄中的主要化学成分进行定量分析[20]，本实验基于整体观，在前期研究基础上采用网络药理学方法，筛选蒲黄活性成分及其作用靶点、通路，保留与血瘀证相关的靶点，并与阳性药阿司匹林分子对接强度比较，以此探讨其治疗血瘀证的分子作用机制。

1 材料与方法

1.1 蒲黄活性成分和作用靶点的筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)搜索蒲黄全部的化学成分，以口服利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和类药性(Drug-Likeness，DL)≥0.18两个ADME (药物在体内的吸收Absorption、分布Distribution、代谢Metabolism、排泄Excretion过程)参数为筛选条件，初步筛选出蒲黄活性成分及其作用靶点，并根据潘祥龙等[2]的研究成果补充蒲黄中具有活血化瘀功效的化合物。经文献筛选补充的化合物在TCMSP数据库进行检索匹配，若TCMSP未收载，则利用Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载化合物分子的3D结构并导入Swiss TargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测活性成分的作用靶点。对获得的蛋白质靶点统一使用Uniprot蛋白质数据库(https://www.uniprot.org/)进行规范。

1.2 蒲黄活性成分作用靶点的筛选

将1.1节初步筛选出的作用靶点输入PharmGKB数据库(https:/org//www.Pharmgk-b)、TTD数据库(http://db.i drblab.net/ttd/)、CTD数据库(http://ctdb ase.org/)，筛选出蒲黄活性成分的作用靶点，保留与血瘀证相关的靶点，舍去非相关靶点。

1.3 蒲黄成分-靶点图的构建

运用Cytoscape3.8.2对结果进行可视化，构建蒲黄成分-靶点图，用“节点(node)”表示成分或靶点或通路，用“边(edge)”表示节点之间的关系。利用Cytoscape3.8.2软件内置工具(network analyzer)分析网络拓扑结构，以连接度(Degree)、介度(Betweenness Centrality)与紧密度(Closeness Centrality)的数值为主要参考，识别活性成分、作用靶点和通路。

1.4 蒲黄活性成分作用靶点的PPI网络构建

为明晰靶点间的相互作用，将1.2节筛选出的蒲黄活性成分作用靶点提交到STRING11.0数据库(https://string-db.org/)，以“Homo sapiens”为筛选条件，构建蛋白质相互作用(PPI)网络，设定阈值“highest confidence”>0.9，其余条件均为默认。利用Metascape平台(https://metascape.org/gp/index.html)挖掘PPI网络中潜在的功能模块，并对功能模块进行描述。

1.5 疾病-靶点图构建

运用Cytoscape3.8.2对结果进行可视化，构建疾病-靶点图，其他步骤与1.3节一致。

1.6 蒲黄活性成分作用靶点功能与通路富集分析

利用Metascape平台将蒲黄活性成分作用靶点进行基因本体论GO生物过程分析(GO Biological Processes)、GO分子功能分析(GO Molecular Functions)、GO细胞组分分析(GO Cellular Components)、KEGG通路富集分析(KEGG Pathway)，分析条件均为默认参数，并对所得结果进行可视化。

1.7 蒲黄成分-靶点-通路网络图的构建

运用Cytoscape3.8.2对结果进行可视化，构建成分-靶点-通路图，其他步骤与1.3节一致。

1.8 分子对接分析

为进一步明晰化合物与靶点结合的活性，利用AutoDock Vina(v4.2.6)软件对蒲黄的活性成分和关键作用靶点进行分子对接，同时将阳性药阿司匹林Aspirin与关键作用靶点进行分子对接。分子对接的步骤主要如下：①收集蒲黄活性成分作用的关键靶点的结构和活性成分的结构——从PDB数据库下载关键作用靶点的3D结构，从TCMSP和Pubchem数据库下载活性成分的mol2或3D结构；②对关键作用靶点和活性成分进行预处理——使用Discovery Studio 4.5对蛋白质结构进行处理，删除水分子、配体、离子，加极性氢和电荷等，并将化合物转成PDB文件；③配体(活性成分)和分子(靶点)的对接——对接过程中，将蒲黄活性成分和关键作用靶点的PDB文件转化成pdbqt文件，通过查阅文献设置盒子参数，而后进行柔性对接；④对接结果的可视化——使用PyMOL(2.4.1)将对接结果可视化。

2 结果与分析

2.1 蒲黄活性成分的获取

利用TCMSP数据库收集33个化学成分，经ADME筛选得到8个活性成分，加上潘祥龙等[2]报道的活性成分8个，总共16个活性成分(表1)。

表1 蒲黄活性成分

2.2 蒲黄活性成分作用靶点的确定

通过在线数据库对蒲黄活性成分的作用靶点进行收集，共获得539个靶点，去除重复靶点后为310个。将310个靶点录入CTD、TTD和PharmGKB数据库，对靶点进行分类，主要根据改善血流动力学、抗凝血、抗炎和调控细胞凋亡(增殖)等4个方向进行分类[21]。最终确定与血瘀证相关的作用靶点83个，并与蒲黄16个活性成分相互作用。

2.3 蒲黄成分-靶点网络图

为观察蒲黄活性成分和靶点之间的关系，使用Cytoscape3.8.2软件对数据进行可视化，获得成分-靶点网络图，其中节点98个，边166条(图1)。拓扑属性分析显示，槲皮素、7-羟基-5,8-二甲氧基-黄烷酮、山奈酚的连接度较高(表2)。

图1 蒲黄成分-靶点网络图

表2 蒲黄活性成分的拓扑属性

2.4 蒲黄活性成分作用靶点PPI网络的构建

通过提交靶点至STRING 11.0数据库，获得蒲黄活性成分作用靶点的PPI网络(图2)。同时分析PPI网络拓扑属性，以连接度(Degree)为指标，连接度值越大，说明靶点连接越紧密，进而说明靶点越重要。分析结果显示，处于蒲黄活性成分作用靶点中心的蛋白，肿瘤坏死因子(TNF，度值=15)、血管内皮生长因子(VEGFA，度值=14)、转录因子(JUN，度值=14)、有丝分裂原激活蛋白激酶14 (MAPK14，度值=14)、蛋白激酶(AKT1，度值=13)、雌激素受体(ESR1，度值=10)等相互联系较为紧密，揭示蒲黄的活血化瘀网络中存在连线密度较高的子网(module)，子网由具有生物学意义的蛋白质复合体和功能

图2 蒲黄活性成分作用靶点PPI网络图

模块组成[22]，同时表明TNF、VEGFA、JUN、MAPK14、AKT1、ESR1可能为蒲黄活性成分作用的关键靶点。上述蛋白质涉及细胞增殖和凋亡、血管内皮生成、癌细胞生长的抑制、免疫反应和炎症反应的参与等方面。采用分子复合物检测算法(MCODE)对相互作用关系进行分析，得到4个module，选取与蒲黄活血化瘀药理相关的3个module (图3)进行描述，结果发现这些module主要涉及对脂多糖的应答、炎症反应和对细菌起源分子的应答等生物过程(表3)。推测蒲黄活血化瘀作用可能与上述过程有关。

红色表示module 1，蓝色表示module 2，绿色表示module 3

表3 蒲黄活性成分作用靶点PPI网络功能描述

2.5 疾病-靶点的网络图构建

为了更直观地观察靶点和疾病的关系，构建疾病-靶点网络图，如图4所示。将靶点分为7个特征病症(这7个特征病症与血瘀证对应的4个模块关联):癌症(Cancer)、血管疾病(Vascular diseases)、免疫系统疾病(Immune system diseases)、神经系统疾病(Nervous system diseases)、炎症(Imflammation)、疼痛(Pain)及其他疾病(Other diseases)，与传统的血流动力学异常、凝血异常、炎症反应和肿瘤对应。表明蒲黄治疗血瘀证可能与7个方面的病症相关。

圆形表示靶点，八边形表示疾病

2.6 蒲黄活性成分作用靶点功能和通路的富集分析

通过Metascape平台对蒲黄活性成分作用的83个靶点进行通路富集分析，并使用在线平台对前20条结果进行可视化(图5)。蒲黄治疗血瘀证相关的生物过程主要有对脂多糖的应答(Response to lipopolysaccharide)、对受伤的反应(Response to wounding)和血液循环(Blood circulation)等(图5a)。与血瘀证有关的通路有血管新生相关的VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)，IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)，NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)等(图5d)。与血瘀证有关的靶点功能主要体现在蛋白激酶(Protein kinase binding)、内肽酶活性(Endopeptidase activity)、细胞因子受体结合(Cytokine receptor binding)等方面(图5c)。与血瘀证相关的细胞组分有细胞器外膜(Organelle outer membrane)、血浆脂蛋白颗粒(Plasma lipoprotein particle)、核膜(Nuclear envelope)等(图5b)。表明蒲黄治疗血瘀证可能与以上描述有关。

图5 蒲黄活性成分作用靶点通路富集分析

2.7 蒲黄成分-靶点-通路网络图的构建

为系统地剖析蒲黄治疗血瘀证的潜在机制，将83个蛋白质靶点映射到前20条KEGG通路上(图6)。结果显示，VEGF信号通路富集靶点15个，IL-17信号通路富集靶点13个，NF-κB信号通路富集靶点13个，这3个通路与血瘀证关联较紧密。这些富集多靶点的通路与血管、中枢神经系统、炎症密切相关，通路富集的靶点信息见表4。

不同的颜色表示不同的类型，浅绿色为靶点，浅紫色为蒲黄活性成分，蓝色为通路。图形面积越大，表示该节点越重要

表4 主要通路富集的靶点信息

续表4

2.8 分子对接结果分析

选取PPI网络中连接度值排前5的靶点，TNF、VEGFA、JUN、MAPK14和AKT1分别和16个与血瘀证相关的蒲黄活性成分、Aspirin进行分子对接。经研究发现，受体和配体的结合能小于-7，表示两者间具有较好的结合作用；结合能数值越低，产生相互作用所需的能量就越低[23]。图7为16个化合物分别与5个核心靶点进行对接的结合能。由图7可知，结合能小于-7的有42种(49.41%)，位于-5与-7之间的有31种(36.47%)，在-1与-4.9之间的有12种(14.12%)。蒲黄成分异鼠李素-3-O-新橙皮苷、(2R)-5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并吡喃-4-酮、儿茶素和表儿茶素等与受体结合可产生5个以上的氢键作用(图8)，具有良好的活性。Aspirin与TNF的结合能最低为-6.6，与蒲黄活性成分相比稍差。结合能小于-5的表示结合活性良好[24]，占总数的85.88%。经过分子对接验证，说明蒲黄活性成分对治疗血瘀证具有较好的活性。

颜色越红，对应的值越小，说明对接强度越大

图8 蒲黄主要成分和靶点的对接结果

3 讨论

随着现代医学的进步，对血瘀证研究越来越深入，较古代判断疾病的“问、闻、望、切”，现代医学更多的是研究疾病的发病机制以及药物对疾病的作用机制，并已经发展到分子层面。由表1可知，蒲黄的活性成分有81.25%是黄酮类化合物。本课题组前期实验表明，生蒲黄和蒲黄炒炭后黄酮类成分变化具有明显差异，并与药效的变化有关[25]，可推断蒲黄总黄酮是重要的活性成分，与本文推断的结果一致。

研究分析PPI网络可知，VEGFA、AKT1、ESR1、TNF、JUN、MAPK14的连接度值在PPI网络中排名前6，说明蒲黄活性成分与这些靶点具有较高的结合活性。VEGFA是参与血管新生的相关因子，该因子可刺激血管内皮细胞分裂增殖，并与炎症指标、疾病活动及血管通透性呈正相关关系，参与固有的免疫调节[26]。AKT1在血管细胞中是以亚型存在，影响血管化反应的多个调控途径，包括抗血管生成、调节血管通透性、血管生成反应和血管成熟[27]。靶点 ESR1调节血管系统，促进损伤血管功能的恢复，并在中枢神经系统中起保护神经的作用[28]。以上研究成果证实PPI网络筛选的靶点可能与血瘀证密切相关，其中VEGFA、AKT1、ESR1、TNF、JUN、MAPK14可能是治疗血瘀证的关键靶点。

KEGG通路富集结果可知，在蒲黄治疗血瘀证过程中涉及的通路可能与VEGF信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路有关。如NF-κB信号通路中的促炎因子、TNF-α、AngⅡ等多种刺激因子被诱导后，在下游调节白细胞介素相关基因、凋亡抑制因子、编码黏附因子相关基因等多种基因的表达，涉及机体免疫调节、炎症反应、细胞周期调控、细胞分化及凋亡等，与Notch信号通路有关，与IKK激酶、IκB激酶的细胞内信号有关。在炎症中，TNF-α、IL-6、NF-κBP65等促炎细胞因子增加，NF-κB炎症基因的表达增加。IL-17信号通路中的IL-17F、IL-25也具有促炎作用[29]。VEGF信号通路与下游信号联级反应，包括PI3K-Akt通路、p38-MAPK通路及Raf通路，进而控制血管内皮细胞的存活、增殖和迁移，促进血管新生并提高血管通透性。血管生成是肿瘤发生发展的重要因素，新生血管不仅为病变组织提供养分，保证其生长繁殖，而且使得肿瘤细胞与个体血液循环直接相通，进而导致恶性肿瘤的发生。上述结果表明，蒲黄治疗血瘀证可能与VEGF信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路等有关。

通过网络药理学的筛选，选取PPI网络中联系紧密的VEGFA、AKT1、TNF、JUN、MAPK14 5个靶点，分别与蒲黄活性成分对接，进一步验证其结合活性，同时将阳性药Aspirin与上述5个靶点进行对接。可视化对接结果显示,表儿茶素与VEGFA、异鼠李素-3-O-新橙皮苷与MAPK14、儿茶素与MAPK14的结合强度较好，Aspirin与5个靶点的结合强度较表儿茶素、异鼠李素-3-O-新橙皮苷、儿茶素弱。Aspirin在治疗血瘀证方面疗效明确且显著，而蒲黄活性成分的对接结果优于阳性药Aspirin，表明蒲黄在治疗血瘀证方面具有极大的潜力，开发价值较大，后续可对其进一步研究。

4 结论

通过网络药理学初步揭示蒲黄多成分、多靶点、多通路的作用特点，发现蒲黄活性成分作用靶点可分为7个病症，这7个特征病症与血瘀证的4个模块相关联，预测蒲黄治疗血瘀证的可能作用靶点和代谢通路；从分子对接结果来看，蒲黄活性成分异鼠李素-3-O-新橙皮苷、(2R)-5,7-二羟基-2-(4-羟基苯基)苯并吡喃-4-酮、儿茶素和表儿茶素等的对接效果均优于阳性药Aspirin。本研究粗略说明了蒲黄治疗血瘀证的分子机制，不仅为蒲黄的活血化瘀作用提供了理论依据，为将来相关研究提供了基础，而且为传统中药材作用机制的研究提供新的思路。