miR-152基因多态性与子痫前期易感性的相关性分析

2021-02-11陈志琴陈文玲潘凌云王慧君

中国妇幼健康研究 2021年12期

陈志琴，陈文玲，潘凌云，王慧君

(1.联勤保障部队第908医院妇儿科，江西南昌 330000；2.江西省妇幼保健院产科，江西南昌 330000)

子痫前期(preeclampsia，PE)是一种在妊娠期间发生的疾病，子痫前期的患病率在发达国家和发展中国家分别为2%～5%和10%[1]。在我国，子痫前期的患病率为8%左右，子痫前期被认为是引起产妇和新生儿死亡的主要原因之一[2]。子痫前期开始于滋养细胞的侵袭，并以内皮细胞功能的衰竭而告终。研究表明，慢性肾功能衰竭、高龄、感染、动脉硬化、胎盘屏障损伤、母体的血液循环中存在滋养细胞及慢性高血压是发生子痫前期的危险因素[3]。子痫前期的病因包括炎症免疫反应、内皮细胞损伤和异常胎盘浸润等。MicroRNA(miRNA)是包含了19～25个核苷酸的单链RNA的小型非编码RNA分子，能够在广泛的生物学过程中发挥作用[4]。miRNA与靶基因的3′-UTR区域结合以调节mRNA的表达。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能会改变miRNA的特性，从而影响其成熟度或改变其与靶标结合的能力。miRNA-152在细胞增殖、集落形成和血管生成中起作用[5]。miRNA通过靶向低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha，HIF-1α)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)来影响血管生成和对缺氧的反应能力[6]。HIF-1α作为miRNA-152的靶基因可调节细胞适应性，其与多种缺氧响应靶基因(如VEGF)结合。miRNA表达失调的原因之一是其基因的变异或SNP。这种多态性与该miRNA的3′-UTR区C到T的变化相关，从而影响基因的甲基化[7]。miRNA对子痫前期发生风险的影响已有相关研究，既往研究显示miR-142、miR-126中的突变与子痫前期的发生有关[8]。本研究旨在探讨miR-152 rs526487多态性与孕妇发生子痫前期的关系，为子痫前期的早期诊断及治疗提供依据。

1资料与方法

1.1临床资料

本研究纳入联勤保障部队第908医院2017年1月至2019年10月收治的156例诊断为子痫前期的孕妇，作为病例组；134例门诊孕检血压正常的孕妇作为对照组。在156例子痫前期患者中，62例为轻度子痫前期，94例为重度子痫前期；100例为早发型子痫前期(妊娠34周前确诊)，56例为晚发型子痫前期(妊娠34周后确诊)。本研究的所有孕妇均已签署知情同意书。子痫前期的定义：妊娠20周后出现收缩压(systolic blood pressure，SBP)≥140mmHg和(或)舒张压(diastolic blood pressure，DBP)≥90mmHg。24h尿液中的蛋白质≥300mg或随机尿蛋白/肌酐≥0.3，或随机尿蛋白(+)。排除标准：患有葡萄胎、肝功能异常、慢性高血压、潜在的肾脏疾病、多胎妊娠、子宫肌瘤、糖尿病、系统性红斑狼疮者。

1.2 miR-152基因的rs526487 SNP检测

静脉血样品收集在含EDTA的试管中，保持在-80℃直至DNA提取。使用盐析法提取基因组DNA。使用限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP)，鉴定了miR-152 SNP rs526487的基因型，其正向和反向引物及其扩增子特性如下：5′-TGTGCGTACTGGCACTGACTGTCGTA-3′，5′-TGAC

GTGGTACTTGCGGTGACTGTCTA-3′。PCR-RFLP预混液的制备如下：最终体积为15μL，0.8μL的10μM正向和反向引物溶液，1.5μL缓冲液(10×)，0.5μL dNTP 10μM，1μL Taq DNA聚合酶，1μL DNA(100ng/μL)和0.75μL 50mM MgCl2。PCR反应程序设置如下：在95℃下变性5min，然后在95℃下进行30个循环25s，在61℃下进行20s，到72℃退火25s，最后延伸72℃ 5min。通过加入1μL缓冲液，0.3μL DdeI(Thermo，USA)消化PCR产物(8.9μL)，然后在37℃下孵育16h，在-20℃下保存。通过在80V下使用4%琼脂糖凝胶进行凝胶电泳获得消化的产物。

1.3统计学方法

使用SPSS 19.0对数据进行录入、分析。多态性位点的基因型与易感性的关系采用χ2检验分析，多态性位点的基因型与易感性的风险分析采用二元Logistic回归分析。检验水准α=0.05。

2结果

2.1两组一般情况比较

病例组年龄、身体质量指数(body mass index，BMI)、身高、体重、三酯甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)比较差异均无统计学意义(P>0.05)；病例组舒张压、收缩压高于对照组，差异有统计学意义(t值分别为10.745、13.885，P<0.05)，见表1。

表1 两组一般情况比较Table 1 Comparison of general information between the two

2.2两组miR-152 rs526487各基因型突变型比较

病例组miR-152 rs526487 AA基因型比例高于对照组，miR-152 rs526487 GG基因型比例低于对照组，两组各基因型所占比例差异有统计学意义(χ2=58.965，P<0.05)，见表2。miR-152 rs526487 AA基因型能增加子痫前期易感性(OR=11.429，95%CI=5.91～22.78，P<0.05)。

表2 两组miR-152 rs526487各基因型突变型比较[n(%)]Table 2 Comparison of miR-152 rs526487 genotype mutations between the two groups[n(%)]

2.3两组miR-152 rs526487各等位基因突变频率比较

病例组miR-152 rs526487 A等位基因的比例高于对照组，miR-152 rs526487 G等位基因比例低于对照组，差异有统计学意义(χ2=104.957，P<0.05)，见表3。miR-152 rs526487 A等位基因频率能增加子痫前期易感性(OR=2.947，95%CI=2.282～3.898，P<0.05)。

表3 两组miR-152 rs526487各等位基因突变频率比较[n(%)]Table 3 Comparison of the mutation frequency of miR-152 rs526487 alleles between the two groups[n(%)]

2.4轻度、重度子痫前期患者的miR-152 rs526487各基因型突变型比较

重度子痫前期患者的miR-152 rs526487 AA基因型比例高于轻度子痫前期，miR-152 rs526487 GG基因型比例低于轻度子痫前期，轻度子痫前期与重度子痫前期患者各基因型比例差异有统计学意义(χ2=48.654，P<0.05)，见表4。miR-152 rs526487 AA基因型与子痫前期的严重程度有关系(OR=13.685，95%CI=4.251～25.698，P<0.05)。

表4 轻度、重度子痫前期患者miR-152 rs526487各基因型突变型比较[n(%)]Table 4 Comparison of miR-152 rs526487 genotype mutations between mild preeclampsia and severe preeclampsia[n(%)]

2.5轻度、重度子痫前期患者的miR-152 rs526487各等位基因突变频率比较

重度子痫前期患者的miR-152 rs526487 A等位基因比例高于轻度子痫前期，miR-152 rs526487 G等位基因比例低于轻度子痫前期，差异有统计学意义(χ2=123.365，P<0.05)，见表5。miR-152 rs526487 A等位基因频率与子痫前期的严重程度有关系(OR=2.741，95%CI=1.895～3.941，P<0.05)。

表5 轻度、重度子痫前期患者的miR-152 rs526487各等位基因突变频率比较[n(%)]Table 5 Comparison of mutation frequency of miR-152 rs526487 alleles between mild preeclampsia and severe preeclampsia[n(%)]

2.6早发型、晚发型子痫前期患者的rs526487各基因型突变型比较

早发型子痫前期患者的miR-152 rs526487 AA基因型比例高于晚发型子痫前期，miR-152 rs526487 GG基因型比例低于晚发型子痫前期，早发型子痫前期与晚发型子痫前期患者各基因型比例差异有统计学意义(χ2=47.547，P<0.05)；miR-152 rs526487 AA基因型与子痫前期发病时间有关系(OR=10.478，95%CI=5.20～23.698，P<0.05)，见表6。

表6 早发型、晚发型子痫前期的miR-152 rs526487各基因型突变型比较[n(%)]Table 6 Comparison of mutation frequency of miR-152 rs526487 alleles between late-onset preeclampsia and early-onset preeclampsia[n(%)]

2.7 早发型、晚发型子痫前期患者的miR-152 rs526487等位基因突变频率比较

早发型子痫前期患者的miR-152 rs526487 A等位基因比例高于对照组，miR-152 rs526487 G等位基因比例低于对照组，其等位基因频率分布差异有统计学意义(χ2=129.365，P<0.05)，见表7。miR-152 rs526487 A等位基因频率与子痫前期的发病时间有关系(OR=2.845，95%CI=2.012～3.998，P<0.05)。

表7 早发型、晚发型子痫前期的miR-152 rs526487等位基因突变频率比较[n(%)]Table 7 Comparison of mutation frequency of miR-152 rs526487 alleles between late-onset preeclampsia and early-onset preeclampsia[n(%)]

3讨论

3.1 miRNA与子痫前期的关系

子痫前期是妊娠期常见的并发症，其特征是患者在妊娠20周后新发高血压和蛋白尿。此外，子痫前期患者可能出现肾功能不全、肝脏疾病。miRNA作为妊娠期疾病的新生物标志物，其表达缺失与妊娠期疾病相关[9]。报道显示，子痫前期患者miR-126表达减少、miR-15b表达增加，miR-126、miR-15b分别具有促血管生成和血管抑制作用[10]，miR-152具有促进细胞增殖、侵袭和血管生成的作用[11]。miR-152被认为是子痫前期的新型潜在生物标志物和治疗靶标。

3.2 子痫前期患者的miR-152 rs526487多态性

近期研究表明miR-152是T辅助淋巴细胞的主要细胞因子，在调节体液免疫反应中起着关键作用。miR-152在怀孕期间增加[12]。miR-152基因位于5q31.1号染色体上的细胞因子基因簇内，其第三内含子有70bp的可变数目的串联重复多态性。miR-152 rs526487多态性包含3个等位基因：AA、AG、GG；GG等位基因的频率高于AA等位基因，AG等位基因很稀少，这在少数人群中已被证实[13]。

3.3 miR-152 rs526487多态性与子痫前期易感性的关系

miR-152 rs526487基因多态性位于miR-152基因的内含子，其可改变信使核糖核酸的剪接，导致不同的剪接变体。研究表明miR-152 rs526487 AA/GG基因型与miR-152的高表达有关，AA等位基因与miR-152的高表达之间存在关联性[14]。这一发现支持了本研究在子痫前期患者中发现血清miR-152水平升高的结果。miR-152 rs526487多态性与多种疾病有关，如平滑肌瘤、子宫颈癌、乳腺癌、终末期肾病、系统性红斑狼疮(SLE)、口腔癌和川崎病[15]。本研究结果发现，病例组miR-152 rs526487 AA基因型比例、A等位基因频率高于对照组，miR-152 rs526487 GG基因型比例、G等位基因频率低于对照组，miR-152 rs526487 AA基因型、A等位基因频率能增加子痫前期易感性，与其他研究结果[14]一致。

3.4 miR-152 rs526487多态性与子痫前期严重程度、发病时间的关系

本研究同时发现，重度子痫前期miR-152 rs526487 AA基因型比例、A等位基因频率高于轻度子痫前期，miR-152 rs526487 GG基因型比例、G等位基因频率低于轻度子痫前期；miR-152 rs526487 AA基因型、A等位基因频率与子痫前期患者病情有关，早发型子痫前期miR-152 rs526487 AA基因型、A等位基因频率高于晚发型子痫前期，miR-152 rs526487 GG基因型、G等位基因频率低于晚发型子痫前期；miR-152 rs526487 AA基因型、G等位基因频率与子痫前期发病时间有关。近期研究发现子痫前期的主要诱因是缺氧，从而导致胎盘功能不全。HIF-1α是一种转录因子，其在胎盘中的表达随着缺氧程度的增加而增加。目前尚无研究调查子痫前期患者中HIF-1α和miR-152表达之间的关系[16]。细胞实验表明，在HIF-1α的靶向调节下，宫颈癌细胞中的缺氧反应诱导了miR-152表达，这对癌细胞的生长具有抑制作用。此外，miR-152 rs526487 AA的等位基因频率与HIF-1α以及乳腺癌、哮喘的风险相关[17-19]。因此推测miR-152 rs526487 AA的等位基因频率升高导致的子痫前期严重程度及发病速度增加可能与HIF-1α有关，这有待于在后续研究中进一步探究。