牛蛙替代蟾蜍在生理教学实验中的应用研究*
2021-02-10徐彩云李天舒李晓慧于慧美郭新荣张大维崔佳润
徐彩云 李天舒 李晓慧 于慧美 郭新荣 张大维 崔佳润
(1.吉林大学基础医学院，长春 130021；2.吉林大学第二医院，长春 130000)
根据周辰[1]报道，蟾蜍是医学生理学实验中传统的实验用动物，可利用其开展蛙心灌流、神经干动作电位测定、神经和肌肉标本制作等实验，但我国的野生动物保护法规定捕捉蟾蜍是违法的行为。因此，依据实验动物“3R”原则，选取能够替代蟾蜍的实验用动物和实验方法，以实现既能满足医学教学需要，又能符合法律法规[2-4]。牛蛙与蟾蜍同属于两栖纲(Amphibian)无尾目(Anura)，在遗传分类学及结构性能方面均非常接近，而且牛蛙属于经济动物，人工养殖、来源广泛，质量可以得到有效保障[5-7]。本研究探讨采用牛蛙替代蟾蜍开展生理学实验的可行性。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1实验动物:牛蛙20只，雌雄不限，体质量80～100 g，50～60 日龄，购于A水产批发市场；蟾蜍20只，雌雄不限，体质量40～60 g，2年龄，购自九台区东湖街道办事处恒达养殖业农民专业合作社，实验动物使用许可证号：SYXK(吉)2017-0003。实验通过吉林大学基础医学院伦理委员会实验动物福利伦理审查，编号：(2021年)研审第(0175)号。
1.1.2试剂与仪器:主要试剂与仪器：重酒石酸去甲肾上腺素(NA)购自远大医药(中国)有限公司；氯化乙酰胆碱(Ach)购自山东西亚化学有限公司；无水氯化钙(CaCl2)、碳酸氢钠(NaHCO3)、氯化钾(KCl)、乳酸(LA)及氯化钠(NaCl)购自北京化工厂有限责任公司；BL-420e实验系统、标本屏蔽盒及张力传感器购自成都泰盟软件有限公司。
1.2 方法
1.2.1蛙心灌流实验牛蛙和蟾蜍离体蛙心制备：①用刺蛙针捣毁实验用动物脊髓及脑；②解剖、暴露心脏，并剪开心包；③心脏插管，用动脉下方备用线结扎玻璃插管；④将心脏离体，固定在多功能铁架台上。在心脏舒张时，夹住心尖，将蛙心夹上的线连接张力传感器着力点上[8-10]，并连接BL-420e机能实验系统，进行动态监测离体心脏的收缩曲线。
不同离子、药物及酸碱的对离体蛙心收缩情况的影响：换掉玻璃管内的所有灌流液加入0.65%NaCl溶液，监测收缩曲线，用新配制的林格氏液冲洗插管至心脏收缩曲线恢复正常。滴加两滴3%CaCl2溶液于灌流液中，监测曲线变化。重复上述步骤，曲线正常后依次加入：1%KCl溶液、0.001% NA溶液、0.001% Ach溶液及3%LA溶液,各两滴于灌流液中，效果明显后，再加两滴2.5%NaHCO3溶液，监测曲线并用灌流液冲洗至曲线恢复正常。
1.2.2坐骨神经-腓肠肌收缩与刺激强度和刺激频率的关系
①骨骼肌标本制作；②标本固定于屏蔽盒内；③连接仪器。用经任氏液润湿的铜锌弓刺激牛蛙或蟾蜍坐骨神经-腓肠肌标本。收缩反应迅速发生，表明标本制备成功[11]。启动系统，分别进行实验记录与观察。
1.2.3神经干动作电位传导速度的测定：将完成制备的牛蛙及蟾蜍坐骨神经干标本置于标本屏蔽盒的电极上，近心端与刺激电极接触，远心端与引导电极相连[12]，并连接生物机能实验系统，刺激神经产生动作电位，测量两对引导电极间的距离(s2-s1)及两个通道的动作电位波峰间的时间差(t2-t1)，则传导速度为：v=(s2-s1)/(t2-t1)
统计学数据，组间进行t检验，P>0.05为差异不显著。
2 结果
2.1 蛙心灌流实验结果
2.1.1离子对心脏收缩的影响:没有离子刺激时，离体心脏节律性跳动。牛蛙及蟾蜍离体心脏分别由林格氏液换为0.65%NaCl溶液，心收缩力减弱；加3% CaCl2溶液，心脏收缩率有所增强，但舒张不完全；加1%KCl溶液，心收缩力减弱(图1)。牛蛙和蟾蜍的离体心脏的收缩受上述离子的影响相似。
图1 NaCl、CaCl2和KCl对离体心脏活动的影响
2.1.2药物对心脏收缩的影响:浓度为0.001%的NA溶液两滴使心脏收缩增强，舒张完全，出现幅度明显增大心博曲线； 浓度为0.001%的Ach溶液两滴使心脏收缩减弱，心率减慢，心脏停止舒张阶段(图2)。牛蛙及蟾蜍的离体心脏收缩受同种实验用药物影响相似。
图2 NA和Ach对离体心脏的影响
2.1.3酸、碱对心脏收缩的影响:浓度为3%的LA两滴，心脏收缩力明显下降，短时间内基本停止跳动，立即滴加2.5% NaHCO3中和LA，心脏恢复节律性跳动(图3)。
图3 LA和NaHCO3对离体心脏活动的影响
由以上三张图可知，在蛙心灌流实验中，牛蛙与蟾蜍在Na+、Ca2+、K+，NA、Ach、LA和NaHCO3作用下对离体心脏活动的影响变化整体趋势一致，无显著性差异。
2.2 坐骨神经-腓肠肌实验结果
2.2.1刺激牛蛙与蟾蜍分离出的坐骨神经-腓肠肌，记录刺激强度与反应的关系，实验结果见图4。肌肉收缩最小时的刺激强度是0.1 V，0.15 V左右的刺激强度肌肉收缩幅度达到最大值且保持不变，两组间无显著性差异。
图4 刺激强度与反应的关系
2.2.2坐骨神经-腓肠肌标本刺激频率与反应的关系，如图5所示。牛蛙及蟾蜍分别给与不同频率的刺激，1.0 Hz肌肉单收缩，收缩幅度很小；6.0 Hz肌肉不完全强直收缩，幅度有所增强；频率>20.0 Hz肌肉开始强直收缩，幅度大且幅度增强。以上结果表明，三种收缩力量为强直收缩>不完全强直收缩>单收缩。
图5 刺激频率与反应的关系
2.3 神经干动作电位传导速度
结果见图6，传导速度v=(s2-s1)/(t2-t1)。牛蛙v=(3.5-2.7)cm/(6.32-5.84)ms=16.6 m/s；蟾蜍v=(4.5-2.5)cm/(18.80-17.28)ms=13.16 m/s。以上结果表明，牛蛙和蟾蜍的神经受到刺激后，神经干动作电位传导速度大致相同。
综合上述实验结果，用牛蛙开展生理教学的蛙心灌流实验，坐骨神经-腓肠肌相关实验中牛蛙与蟾蜍的实验结果趋于一致。
3 讨论
本研究对比牛蛙与蟾蜍在蛙心灌流实验结果得到坐骨神经-腓肠肌实验结果驱于一致，表明可以利用牛蛙替代蟾蜍进行生理学教学实验。
另外，牛蛙属于经济动物，供应途径和动物质量可以得到有效的保证。牛蛙表面光滑，且没有毒液，可以消除学生对蟾蜍的外观和毒液有顾忌和抵触心理和情绪。采用可养殖的经济动物替代野生动物开展教学实验，不仅提高实验教学结果的可控性，也提高学生的法律意识，是现阶段课程思政的重要组成部分[13-14]。
牛蛙为人工养殖，也存在一定局限性。本研究采用的牛蛙和蟾蜍比较，日龄较短未达到个体成熟，导致肌纤维、血管弹性及性差；蟾蜍为野生动物和牛蛙比较，日龄长，肌纤维及血管弹性和韧性都好，在蛙心灌流实验中蟾蜍成功率大于牛蛙。
牛蛙因其生长较快，体型较大、四肢较蟾蜍发达及体表湿滑，因此在手持固定时比较困难，而且毁髓针在扎入牛蛙的枕骨打孔时，易扎伤。因此在实验过程中，要小心操作，避免受伤。另外，在操作中也发现，牛蛙的后肢中伴随着神经干的血管相对于蟾蜍较难剥离，需要在剥离过程中熟练操作。
牛蛙替代蟾蜍用于生理学教学实验，符合实验动物“3R”(替代、减少、优化)原则，有利于生理学实验教学在符合国家法律法规下规范开展实验教学工作。
