miR-143-3p通过调节TGIF2的表达在甲状腺癌中的作用研究*

李 佳 李 涛 潘 婧 赵 茜 刘 莉

(1.保定市第二医院检验科，保定 071000)(2.保定市南市区妇幼检验科，保定 071000)(3.保定市第五医院检验科，保定 071000)

甲状腺癌(thyroid cancer，TC)是内分泌器官最常见的恶性肿瘤[1]，其发病率最近一直在稳步上升[2-3]。间变性甲状腺癌(anaplastic thyroid cancer，ATC)是甲状腺疾病中最具攻击力的类型。根据Ain等[4]报道，尽管ATC在所有甲状腺肿瘤中的发病率不到2%，却导致14%～39%的TC相关死亡病例。ATC对大多数传统疗法有抵抗力，并且对放射碘治疗无效[5]。因此，有必要揭示TC的进展机制并寻找抑制因子。某些微小RNA(miRNA)已被证实具有抑癌作用，具抑制TC发生和转移的能力[6-7]。Wang等[8]表明，与正常甲状腺组织和细胞系比较，乳头状甲状腺癌(papillary thyroid cancer，PTC)组织和甲状腺癌细胞中miR-143-3p的表达明显降低，Jahanbani等[9]揭示miR-143-3p表达的下调可能与经典PTC中的攻击行为有关。TGF-β诱导因子同源框2(TGF-β-induced factor homeobox 2，TGIF2)属于TALE同源域蛋白家族，TGIF2通过与TGF-β/BMP途径相互作用或直接与DNA结合而充当转录抑制因子[10-11]。研究表明TGIF2在非小细胞肺癌和骨肉瘤中的表达均上调并起到促癌作用[12-13]。本研究检测miR-143-3p在不同ATC细胞中的表达量，分析miR-143-3p和TGIF2的靶向关系，并通过上调miR-143-3p探究其在TC发展进程中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

2，7-二氯二乙酸酯(DCFH-DA)购自Sigma；DMEM细胞培养液和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Invitrogen；反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；TRIzol试剂、RIPA裂解液、BCA试剂盒、ECL显色液和免疫组化试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；β-actin、TGIF2、P65、p-P65、LGR5和OCT4抗体购自Abcam；双荧光素酶报告系统购自Promega；IL-6、IL-1β和iNOS ELISA试剂盒购自R&D；SOD测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；miR-143-3p mimic和其阴性对照miR-NC、pcDNA-TGIF2和其阴性对照pcDNA均由上海吉玛公司合成；FACScan流式细胞仪购自Beckman Coulter；光学显微镜和倒置荧光显微镜购自Olympus；Nanodrop 2000购自中国赛默飞世尔公司。

1.2 分组和模型建立

16只18～20 g的SPF级4周龄BALB/c裸鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物生产许可证号为：SCXK(京)2016-0011。所有实验操作程序均经过保定市第二医院实验动物伦理委员会批准，批准号：IACUC-20190423-17。将裸鼠饲养于SPF环境中，房间温度控制在22～25 ℃，相对湿度50%～60%，昼夜交替12 h/12 h，自由饮水进食，适应性喂养一周后进行实验。将BALB/c裸鼠随机分为miR-NC和miR-143-3p mimic组，TC细胞CAL-62分别转染miR-NC或miR-143-3p mimic，并将细胞密度调整至5×106个/mL进行皮下注射。连续饲养30 d，每5天记录一次小鼠肿瘤体积，30 d后处死小鼠，取出肿瘤团块称质量并进行石蜡包埋切片，将石蜡切片脱蜡，柠檬酸钠缓冲液修复，滴加一抗至切片4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃ 1 h，滴加HRP标记的链酶蛋白亲和素，37 ℃作用 40 min，洗涤后避光显色并用苏木素复染细胞核。封片后使用光学显微镜观察OCT4阳性细胞。

将CAL-62细胞分为以下6组，即：对照组、miR-NC、miR-143-3p mimic、pcDNA、pcDNA-TGIF2和miR-143-3p+TGIF2。

1.3 细胞培养及转染

人甲状腺上皮细胞TEC、人TC细胞CAL-62、KMH-2及8505C均购自美国菌种保藏中心(ATCC)，将细胞在含有10%FBS，100 U/mL青霉素和100 g/mL链霉素的DMEM中于37 ℃、含5%CO2湿润条件下培养。将CAL-62细胞分为对照组、miR-NC组、miR-143-3p mimic组、pcDNA组和pcDNA-TGIF2组及miR-143-3p mimic+pcDNA-TGIF2共转染组，按分组转染对应序列，所有转染均使用lipofectamine 2000进行，转染后48 h收获细胞用于后续实验。

1.4 Real-time PCR检测基因表达

用TRIzol试剂从TEC细胞、TC细胞、转染的CAL-62细胞和瘤组织中提取总RNA，用Nanodrop 2000测定RNA的纯度和浓度。取等质量的总RNA作为模板，使用反转录试剂盒转录成cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增循环为：预变性95 ℃、3 min，变性95 ℃、15 s，退火60 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，35个循环，终延伸72 ℃、5 min。

1.5 Western blot检测蛋白表达

将CAL-62细胞转染48 h后，RIPA试剂抽提细胞中总蛋白，BCA定量，点样30 μg/孔， SDS-PAGE分离并转膜至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭PVDF膜后加一抗4 ℃孵育过夜，第2天加二抗室温孵育2 h，ECL显色液显色，凝胶成像仪进行相对定量。

1.6 双荧光素酶报告基因分析

生物信息学预测网 (https://cm.jefferson.edu/rna22/Interactive/) 分析miR-143-3p与TGIF2 3′UTR之间的结合位点。构建TGIF2 Lentireporter-luciferase野生型和突变型载体，实验分组为：TGIF2 3′UTR wt + miR-NC、TGIF2 3′UTR wt + miR-143-3p mimic、TGIF2 3′UTR wt+miR-143和TGIF2 3′UTR wt+miR-143-3p mimic。将3×104个 CAL-62细胞接种并培养到24孔板中，按分组共转染。转染24 h后，根据Dual-Luciferase®Report报告基因试剂盒说明书检测海肾荧光素酶和萤火虫荧光素酶的活性。

1.7 细胞检测

CAL-62细胞转染后，根据 ELISA 试剂盒说明书对细胞上清液中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、白细胞介素(interleukin,IL)-1β和IL-6水平进行检测。

CAL-62细胞转染后，用PBS冲洗细胞两次，加入裂解缓冲液，0～4 ℃匀浆30 min后，将裂解产物在4 ℃、12 000 g离心15 min，收集上清液，按照说明书检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的含量。

转染后，将5 ×104个CAL-62细胞接种在96孔板中，在37 ℃、5%CO2培养48 h后，用PBS洗涤后，将细胞与10 μmol/L的DCFH-DA在37 ℃黑暗中孵育30 min。荧光显微镜下观察DCFH-DA密度(绿色荧光)并拍照统计。

1.8 球体形成测定

转染后，将2×103个CAL-62细胞接种于超低附着24孔板中，在DMEM/F-12培养基 (含有10 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、1% B27、5 μg/mL 胰岛素和0.03% LA717) 中培养10 d后，显微镜下拍照，并使用Image J软件手动计算球体直径大小。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 TC细胞中miR-143-3p的表达下调

与TEC组相比，人TC细胞CAL-62、KMH-2和8505C 中miR-143-3p的表达显著下调(P<0.05)，见图1。后续实验选择miR-143-3p表达最低的CAL-62细胞进行实验。

图1 人甲状腺上皮细胞和不同TC细胞中miR-143-3p的表达

2.2 miR-143-3p与 TGIF2靶向关系验证

如图2A所示，生物学预测结果证明，TGIF2和miR-143-3p之间存在特异性结合位点。双荧光素酶报告基因检测结果表明，miR-143-3p mimic组对TGIF2 3′UTR mut的荧光素酶活性无明显影响，但明显降低TGIF2 3′UTR wt的荧光素酶活性(P<0.05，图2A)。因此，TGIF2是miR143-3p的直接靶标。与对照组相比，miR-143-3p mimic组miR-143-3p的表达显著升高(P<0.05)，miR-NC无统计学差异(图2B)。与对照组相比，miR-143-3p mimic组TGIF2 mRNA表达明显降低(P<0.05)，pcDNA-TGIF2组TGIF2 mRNA表达显著升高(P<0.05)，miR-NC组和pcDNA组无统计学意义；与pcDNA-TGIF2组相比，miR-143-3p+TGIF2组TGIF2 mRNA表达明显降低(P<0.05，图2C)。TGIF2蛋白的表达趋势与mRNA表达一致(图2D、图2E)。

图2 CAL-62细胞中miR-143-3p和TGIF2靶向关系验证及其表达

2.3 过表达miR-143-3p通过对TGIF2的负调控抑制炎症因子的分泌

与对照组比较，miR-143-3p mimic组细胞上清液中iNOS、IL-1β和IL-6含量明显减少(P<0.05)，P65磷酸化水平降低(P<0.05)，pcDNA-TGIF2组细胞上清液中iNOS、IL-1β和IL-6含量明显增加(P<0.05)，P65磷酸化水平升高(P<0.05)；与pcDNA-TGIF2组比较，miR-143-3p+TGIF2组逆转了过表达TGIF2导致的炎症因子水平上调和P65磷酸化水平升高(见图3)。

图3 miR-143-3p负调控TGIF2对炎症因子表达的影响

2.4 过表达miR-143-3p通过对TGIF2的负调控增强氧化应激反应

如图4所示，与对照组相比，miR-143-3p mimic组细胞中ROS含量明显增加(P<0.05)，SOD含量明显减少(P<0.05)，pcDNA-TGIF2组结果与之相反；与pcDNA-TGIF2组相比，miR-143-3p和 TGIF2共转染组细胞中ROS含量明显增加(P<0.05)，SOD含量明显减少(P<0.05)。

图4 miR-143-3p负调控TGIF2对ROS和SOD产生的影响

图5 miR-143-3p负调控TGIF2对甲状腺癌细胞的干细胞样特性的影响

2.5 过表达miR-143-3p通过对TGIF2的负调控抑制TC细胞的干细胞样特性

与对照组相比，miR-143-3p mimic组癌细胞成球直径明显变小(P<0.05)，pcDNA-TGIF2组癌细胞球体直径明显变大(P<0.05)；与pcDNA- TGIF2组比较，miR-143-3p+TGIF2组癌细胞成球直径变小(P<0.05)。与对照组相比，miR-143-3p mimic组CAL-62细胞中LGR5和OCT4蛋白表达显著下调(P<0.05)，pcDNA-TGIF2组LGR5和OCT4蛋白表达显著上调(P<0.05)；与pcDNA-TGIF2组比较，miR-143-3p+TGIF2组LGR5和OCT4蛋白表达显著下调(P<0.05)。

2.6 过表达miR-143-3p通过对TGIF2的负调控制抑裸鼠体内移植瘤的生长

与miR-NC组相比，miR-143-3p mimic组移植瘤质量和体积明显减小(P<0.05)，且瘤组织中miR-143-3p表达明显上调(P<0.05)，TGIF2表达明显下调(P<0.05)，OCT4阳性细胞数目明显减少(P<0.05)如图6所示。

图6 miR-143-3p对裸鼠肿瘤形成的影响

3 讨论

越来越多的证据表明，甲状腺肿瘤中miRNA失调与TC的发生密切相关[14-15]，miR-199a-5p通过靶向Snail信号抑制ATC细胞的上皮间质转化[16]。miR-143-3p在PTC中的表达降低，并通过靶向MSI2诱导癌细胞凋亡并抑制细胞的增殖、侵袭和迁移[8]。TGIF2通常通过充当microRNA的靶标而参与癌症的治疗[17-18]。本研究结果表明，miR-143-3p在不同的ATC细胞中的表达降低，与之前结果一致。通过生物信息学预测和双荧光素酶报告分析结果证实TIGF2是miR-143-3p的直接靶标，miR-143-3p负调控TIGF2的表达，抑制裸鼠移植瘤的生长及癌细胞干细胞样特性从而抑制ATC的发展。

慢性炎症在癌症发展中起着至关重要的作用，炎症不仅起着肿瘤促进剂的作用，而且还通过诱导DNA损伤、血管生成、侵袭和转移而影响肿瘤发生的其他进程[19-20]。miRNA通过调节炎症来驱动肿瘤进展[21-22]，miR-143-3p表达的上调可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路来改善肺炎性因子水平并减少肺炎支原体小鼠肺泡上皮细胞凋亡[23]。结果表明，过表达miR-143-3p可明显降低促炎因子iNOS、IL-1β和IL-6的表达水平，并下调NF-κB-p65蛋白磷酸化水平。因此，miR-143-3p可通过抑制炎症反应阻止肿瘤的恶性发展。

凋亡是根除癌前细胞和癌细胞的主要机制，可以用作癌症药物开发研究的重要靶标[24]。ROS的过度生成导致癌细胞氧化还原稳态的破坏[25]，降低细胞内抗氧化剂水平，并增加脂质过氧化水平，促进癌症的早期凋亡[26]。SOD将有害的超氧化物自由基转化为过氧化氢和分子氧，随后被过氧化氢酶催化转化为水[27]。本研究结果表明，miR-143-3p过表达可明显增加ROS的产生，降低SOD水平。因此，miR-143-3p可通过破坏癌细胞中氧化还原的稳态诱导癌细胞凋亡阻滞癌症进程。

癌症干细胞(cancer stem cell，CSC)是能够引发新肿瘤的肿瘤细胞亚群[28]，是肿瘤内异质性的主要原因[29]。TGIF2可以增强OCT4的转录以调节卵巢癌细胞的干细胞样特性[30]，LGR5和OCT4是CSC的标志物[31]。本研究中miR-143-3p mimic明显逆转过表达TGIF2诱导的TC干细胞团块直径的增大以及LGR5和OCT4蛋白的上调。因此，miR-143-3p可通过抑制TC细胞干样特性阻止癌症恶化。

综上所述，miR-143-3p通过对促癌基因TGIF2的负调控抑制ATC细胞炎症因子的分泌和干细胞样性，诱导氧化应激反应促进癌细胞凋亡，并抑制体内肿瘤的生长，从而起到抗癌作用。本研究结果表明miR-143-3p可能是治疗ATC的一个有希望的分子靶标。