楸树叶绿体基因组密码子偏性分析

李凤 辛静 辛雅萱 肖遥 屈亚亚 王军辉 麻文俊 辛培尧

摘要：【目的】分析楸樹叶绿体基因组密码子使用偏性，为楸树乃至梓属植物叶绿体基因组学、物种进化特征及遗传多样性分析等研究提供理论依据。【方法】利用Codon W 1.4.2及EMBOSS expiorer的cusp和chips软件对51个楸树叶绿体基因的编码区（CDS）序列进行密码子相关参数、中性绘图、ENC-plot和PR2-plot等分析，并通过构建高、低表达偏性基因库，以ENC值和RSCU值为参考标准，最终筛选最优密码子。【结果】51个基因密码子的平均GCall含量为38.48%，密码子不同位置GC含量为：GC1（47.03%）>GC2（39.93%）>GC3（28.09%），说明第3位的GC并非均匀分布;ENC为34.93～56.50，平均为46.87。GC2与GC1呈极显著正相关（P<0.01），而GC3与GC1和GC2无显著正相关（P>0.05）;ENC与GCall、GC1、GC3和N均呈显著正相关（P<0.05，下同）;密码子数（N）与GC3和ENC呈显著正相关。RSCU>1的密码子共有30个，其中，以A或U结尾的密码子有29个。中性绘图分析结果显示，GC3与GC12相关系数为0.0188，二者无显著相关性，回归系数为0.143。ENC-plot分析结果显示，大部分基因偏离了ENC预期标准曲线，少数分布在预期曲线附近;有7个密码子分布在GC3含量-0.05～0.15区间，其余区间共有44个密码子，而这44个基因离ENC标准曲线较远。PR2-plot分析结果显示，落在中线上的基因较少，平面图右下方的基因分布较多，表明在各碱基使用频率方面存在偏性，即T>A，G>C。各碱基使用频率存在偏性（T>A，G>C），说明基因组密码子的偏性更多受选择效应的影响。最终筛选出7个为最优密码子UUU、CUU、CCU、AAA、GAU、CGA和GGU。【结论】楸树叶绿体基因组密码子偏性较弱，偏好使用A或U结尾的密码子，主要受选择压力的影响，受突变等其他因素影响较小。

关键词： 楸树;叶绿体基因组;密码子偏好性;最优密码子

中图分类号：S792.99                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）10-2735-09

Abstract：【Objective】Analyzed the codon usage bias of Catalpa bungei C. A. Mey. chloroplast genome to provide theoretical basis for the research of C. bungei and even Catalpa chloroplast genomics，species evolution characteristics and genetic diversity analysis. 【Method】Codon correlation parameters，neutral plots，ENC-plot and PR2-plot were analyzed for 51 chloroplast gene coding regions （CDS） sequences of C. bungei by Codon W 1.4.2 and cusp and chips of EMBOSS expiorer. And through the constitutive high and low expression-biased gene library， ENC value and RSCU value were used as reference criteria to screen the optimal codon. 【Result】The average GCall content of 51 gene codons was 38.48%，and GC content at different positions of codons was as follows： GC1（47.03%）>GC2（39.93%）>GC3（28.09%），indicating that GC at the third position was not evenly distributed. ENC ranged from 34.93 to 56.50，with an average of 46.87. GC2 was extremely significantly positively correlated with GC1 （P<0.01），while GC3 was not significantly positively correlated with GC1 and GC2 （P>0.05）.  ENC was significantly positively correlated with GCall，GC1，GC3 and N （P<0.05，the same below）.  The codon number （N） was positively correlated with GC3 and ENC. There were 30 codons with RSCU>1，among which 29 codons ended in A or U. Neutral plot analysis results showed that the correlation coefficient between GC3 and GC12 was 0.0188，and there was no significant correlation between them，and the regression coefficient was 0.143. ENC-plot analysis showed that most of the genes deviated from the ENC expected standard curve，and a few were distri-buted near the expected curve. There were 7 codons distributed in the range of GC3 content from -0.05 to 0.15，and there were 44 codons in the other regions，which were far from the ENC standard curve. PR2-plot analysis results showed that fewer genes fell on the middle line，and more genes were distributed in the lower right part of the graph，indicating that there was a bias in the use frequency of each base，namely T>A，G>C.There was bias （T>A，G>C） in the use frequency of each base，indicating that the bias of the genome codon was more influenced by the selection effect. Finally，7 optimal codons were selected as UUU，CUU，CCU，AAA，GAU，CGA and GGU. 【Conclusion】The chloroplast genomes of C. bungei show weak codon bias，preferring to use codons ending in A or U，which is mainly affected by selection pressure and less affected by mutation and other factors.

Key words：Catalpa bungei C. A. Mey.; chloroplast genome; codon bias; optimal codons

Foundation item： Fundamental Research Funds for the Central Public Welfare Research Institutes（CAFYBB2017 ZA001-8）

0 引言

【研究意义】楸树（Catalpa bungei C. A. Mey.）是紫葳科（Bignoniaceae）梓属（Catalpa Scop）落叶乔木，原产我国，分布范围较广，主产地为黄河流域和长江流域，素有“木王”之美称，其材质不翘不裂，用途广泛，树体高大挺拔，树姿优美，集用材、观赏、环保和医用价值等优点于一身，是我国特有的优质、药用和园林观赏树种（吴丽华等，2010）。叶绿体基因组不同于细胞核中的基因组DNA，通常是双链环状结构，不与蛋白质结合，拥有一套完整的复制、转录和翻译系统（辛雅萱等，2020），其结构保守，并包含了长、短单拷贝区（LSC和SSC）和2个反向重复区（IR）共4个大片段，这些特性有利于分析叶绿体基因组。目前叶绿体基因组已广泛用于分子进化、生物多样性分析、DNA条形码、系统发育和遗传表达等研究领域（倪梁红等，2015;范李强等，2018）。研究表明，同义密码子在无任何自然选择和基因突变等压力影响的情况下以同样的概率出现，但如果受到影响则会导致同义密码子的偏性使用，被称为密码子使用偏性（Codon usage bias，CUB），该现象广泛存在于生物中（吴宪明等，2007;吴妙丽等，2019;王艳等，2021）。研究叶绿体密码子偏性可为叶绿体基因工程相关研究打下基础（季凯凯等，2020）。因此，分析楸树叶绿体基因组密码子使用偏性，确定密码子的使用模式及其形成因素，对楸树乃至梓属植物叶绿体基因组学、物种进化特征及遗传多样性分析等研究具有重要意义。【前人研究进展】大量研究证实，不同物种的叶绿体基因组密码子偏性因物种而不同（原晓龙等，2021），但相同物种或者亲缘关系较近的物种之间的密码子使用偏性相似（王英等，2020）。叶绿体基因组密码子使用偏性影响的因素除了受选择压力和自然压力外，tRNA丰度（Moriyama and Powell，1997）、mRNA二级结构（Gu et al.，2004）、外源基因碱基突变（Hershberg and Petrov，2008）及在寄主中的表达水平（武立伟等，2020）、蛋白表达效率和准确性（Lee et al.，2009;Brandls and Hughes，2016）等均会影响密码子使用偏性的产生。目前分析密码子的使用偏性、筛选最优密码子及通过优化密码子来提高外源基因在宿主中的表达水平方面的研究较多（Stephen et al.，2013;Deng et al.，2020），如余桂容等（2015）通过密码子优化提高苏云金芽胞杆菌（Bt）cry1Ah基因在转基因玉米中的表达水平;王超等（2020）对朝仓花椒（Zanthoxylum piperi-tum DC.var. inerme Makino）基因的密码子使用偏性进行分析，确定花椒基因使用偏性较高的密码子，通过优化密码子的方式提高花椒基因在物种内的表达水平;柳燕杰等（2020）通过分析美国红梣（Fraxinus pennsylvanica Marsh）叶绿体基因组密码子使用模式及影响密码子使用偏性的因素，确定其密码子偏性和最优密码子，从而预测基因的表达水平，确定未知基因的位置和改良外源基因。随着叶绿体的基因工程在优良品种繁育和种质资源保护中的作用日益凸显，且大量物种的叶绿体基因组序列相继公布，对不同物种的叶绿体基因组的研究日益增多（梁璇等，2021）。近年来，对叶绿体基因组密码子偏性已在酸枣（Ziziphus jujuba）（胡晓艳等，2019）、巴山木竹（Arundinaria fargesii）（吴妙丽等，2019）、印度簕竹（Bambusa bambos）（吴妙丽等，2019）、杜梨（Pyrus betulifolia）（辛雅萱等，2020）等多种植物中进行研究。【本研究切入点】我国楸树在优良新品系的选择（麻文俊等，2012）、抗旱胁迫的评价（董蕾等，2014）及规模化繁育（孟路等，2020）等方面的研究已较成熟。虽然楸树叶绿体基因组的测序现已完成，但未见有关楸树密码子偏性的研究报道。【拟解决的关键问题】利用Codon W 1.4.2及EMBOSS expiorer的cusp和chips软件对楸树叶绿体基因组密码子的使用偏性进行相关分析，从而确定最优密码子及密码子偏性的主要影响因素，旨在为楸树的遗传变异及基因组学的研究提供强有力的分子理论依据。

1 材料和方法

1. 1 序列的获取和筛选

从NCBI数据库（http//www.ncbi.nlm.gov/）中下载楸树叶绿体基因组序列（GenBank登录号为MT610898，序列全长158238 bp），经筛选共获得84个基因的编码区（CDS）序列。为了降低因序列较短而造成的误差，从84个基因序列中去除重复序列、长度小于300 bp的序列及内部含有终止密码子和不完整的序列，最终获得起始密码子为ATG，终止密码子为TAA、TGA和TAG的51个基因序列，用于后續序列分析。

1. 2 密码子相关参数计算

通过Codon W 1.4.2分析51个基因序列，并获取其相对同义密码子使用度（RSCU）（即某一特定密码子所编码氨基酸时的所有密码子相对使用次数），把RSCU作为判断密码子是否存在偏性的标准：当RSCU=1时，证明该密码子使用上无偏性;RSCU>1时，则表明其使用频率相对较高，存在偏性（牛元等，2018;胡振民等，2020）。利用EMBOSS expiorer中的cusp软件分析不同基因序列的GC1、GC2、GC3（分别代表密码子第1位、第2位和第3位的GC含量）和GCall（密码子总GC含量）含量;并用EMBOSS expiorer中的chips软件分析有效密码子数（ENC）（即密码子非均衡使用的偏好程度），ENC的取值范围为20～61（冯瑞云等，2019）。最后，使用SPSS 21.0作相关分析。

1. 3 中性绘图分析

根据不同基因密码子的GC3含量和GC12含量[即GC12=（GC1+GC2）/2]进行中性绘图，从而分析判断影响密码子偏性形成的因素（王鹏良等，2018）。若GC3与GC12相关性强，则说明突变压力对密码子3个位置的碱基的使用影响较大;若GC1、GC2与GC3相关性弱，则表明选择压力对密码子使用影响较大（秦政等，2018;惠小涵等，2020）。

1. 4 ENC-plot绘图分析

根据不同基因密码子的GC含量和ENC，利用ENC-plot制作散点图，并计算ENC的标准曲线，公式为：ENC=[29GC32+（1−GC3）2]+GC3+2，从而分析突变压力在密码子使用过程中的作用（尹为治等，2020）。如果各基因分布在ENC预期曲线的周围，说明叶绿体基因组密码子的使用偏性受突变压力的影响较大，而如果各基因分布在ENC预期曲线的下方或偏离预期曲线，则表明叶绿体基因组密码子的偏性受到选择压力的影响较大（王鹏良等，2018）。

1. 5 PR2-plot绘图分析

为了探究不同基因密码子第3位碱基的嘌呤与嘧啶之间的突变压力是否平衡，即A、T与G、C之间均衡分布的情况，对由同义密码子编码的氨基酸第3位上A、T、C、G 4種碱基组成情况进行PR2-plot绘图分析（金刚，2019），以确定楸树叶绿体基因组密码子偏性的影响因素。其中，以G3/（G3+C3）、A3/（A3+T3）分别为横、纵坐标，PR2偏倚图的中心（0.5，0.5）表示A=T且C=G（宋辉等，2015）。其余点由中心点向该点发出的矢量表明基因的偏倚程度及方向（陆奇丰等，2020）。

1. 6 最优密码子分析

为了选出楸树叶绿体基因组中的最优密码子，利用Codon W 1.4.2计算每个密码子的RSCU，把RSCU>1的密码子定义为高频密码子。以5个基因的ENC作为偏性标准，对其进行从小到大排序，取前后两端10%基因（前后各5个基因）构建高、低表达偏性基因库。两组间的差值ΔRSCU≥0.08（ΔRSCU=RSCU高表达- RSCU低表达）的密码子作为高表达优越密码子，最终将同时满足RSCU>1和ΔRSCU≥0.08的密码子作为楸树叶绿体基因组的最优密码子（胡莎莎等，2016）。

2 结果与分析

2. 1 密码子碱基组成及偏好性分析

由表1可知，51个基因密码子的平均GCall含量为38.48%，平均GC1、GC2和GC3含量分别为47.03%、39.93%和28.09%，即GC3含量明显低于GC1和GC2含量，说明第3位的GC并非均匀分布，分布趋势为GC1>GC2>GC3。可见，密码子第3位以A或U（T）结尾的频率高于以G或C结尾的频率。51个基因的ENC为34.93～56.50，平均为46.87，说明楸树叶绿体基因组的密码子偏性较弱。

对楸树叶绿体基因的密码子数量（N）、ENC和各密码子的GC含量进行相关分析，结果如表2所示。GC2与GC1呈极显著正相关（P<0.01，下同），而GC3与GC1和GC2无显著正相关（P>0.05，下同），说明密码子的第1位与第2位的碱基相似度较高，但二者与第3位的碱基相似度较低;GCall与GC1和GC3均呈极显著正相关，与GC2呈显著正相关（P<0.05，下同）;ENC除了与GC2无显著负相关外，与GCall、GC1、GC3和N均呈显著正相关，说明密码子3个位置的碱基组成对ENC的影响有所不同，其中，第1位和第3位碱基组成对密码子的偏性有影响。密码子数（N）除了与GC3和ENC呈显著正相关外，与其他数值均无显著相关。

由表3可知，RSCU>1的密码子共有30个，其中，以U（16个）或A（13个）结尾的密码子数量明显多于以G（1个）结尾的密码子，说明以A或U结尾的密码子是楸树叶绿体基因组偏好的密码子。

2. 2 中性绘图分析结果

由图1可知，GC12含量为0.20～0.37;GC3含量为0.35～0.55，二者的相关系数和回归系数分别为0.0188和0.143，表明在密码子的第1、2位碱基与第3位碱基组成相关性较弱，楸树叶绿体基因组编码基因保守性较高，密码子偏好性受选择压力的影响较大。

2. 3 ENC-plot绘图分析结果

由图2可知，在51个基因中，大部分基因偏离了ENC预期标准曲线，少数分布在预期曲线附近，说明楸树叶绿体基因组的偏性受选择压力的影响较大，受基因突变压力的影响较小;位于标准曲线上方的基因密码子偏性较弱，而位于标准曲线下方的基因密码子偏性较强。由不同GC3含量区间分布的密码子数量（表4）可知，有7个密码子分布在-0.05～0.15区间，其余区间共有44个密码子，而这44个基因距离ENC标准曲线较远（图2），表明楸树叶绿体基因组密码子的使用偏性主要受选择压力的影响较大，而受其他因素（如碱基突变等）的影响相对较小。

2. 4 PR2-plot绘图分析结果

由图3可知，51个基因在PR2平面图的4个部分并非均匀分布，且落在中线上的基因较少，平面图右下方的基因分布较多，表明各碱基使用频率存在偏性，即T>A，G>C，说明选择压力不是影响楸树叶绿体基因组密码子偏性的唯一因素，突变等其他因素也对楸树叶绿体基因组的密码子偏性产生一定的影响。

2. 5 最优密码子的筛选

从51个楸树叶绿体基因选取中5个高表达基因（petA、ndhC、rps2、atpE和rps4）和5个低表达基因（cemA、atpF、psbA、rps18和rps14），然后利用Codon W 1.4.2计算出两组基因同义密码子的RSCU，再计算出ΔRSCU，结果（表5）表明，高频密码子有24个（RSCU≥1），高表达优越密码子有12个（ΔRSCU≥0.08，用*表示），ΔRSCU≥0.30（用**表示）的密码子有10个，ΔRSCU≥0.50（用***表示）密码子有4个。同时满足高频（ΔRSCU≥0.08）和高表达（RSCU≥1）的密码子有7个，确定为最优密码子，分别是UUU、CUU、CCU、AAA、GAU、CGA和GGU，其中5个以U结尾，2个以A结尾。

3 讨论

GC3是密码子偏性的一个重要判断指标。本研究对楸树叶绿体基因密码子3个位置的GC含量进行分析，结果表明，GC1和GC2含量显著高于GC3含量，说明楸树叶绿体基因组偏好使用U或A结尾的密码子，RSCU分析结果也证实该结论。在糜子（Panicum miliaceum L.）（刘慧等，2017）、普通油茶（Camellia oleifera Abel）（王鹏良等，2018）和西南桦（Betula alnoides Hamilton）（原晓龙等，2020b）等植物的叶绿体基因组偏性的研究也发现，这些植物偏好使用A或U结尾的密码子。本研究最终筛选出的7个最优密码子，均以U或A结尾，与杜梨（Pyrus betulifolia Bge.）（辛雅萱等，2020）的最优密码子研究结果一致。

选择压力是引起密码子使用偏性的主要因素，突变等其他方面的因素也发挥一定作用（赵森等，2020）。本研究发现，楸树叶绿体基因的ENC为34.93～56.50，平均为46.87，说明楸树叶绿体基因密码子偏性较弱，与大花香水月季（Rosa odorata var. gigantean Rehd. & Wils）（牛元等，2018）、酸棗[Zizi-phus jujube var. spinosa（Bunge） Hu ex H. F. Chow]（胡晓艳等，2019）、灰毛浆果楝[Cipadessa cinerascens（Pellegr.） H. -M.]（原晓龙等，2020c）等植物的叶绿体密码子使用偏性研究结果一致，由此推测叶绿体基因组结构的保守性是导致密码子使用偏性的主要因素之一。结合相关分析和中性绘图分析结果发现，碱基突变也是影响楸树叶绿体基因组偏性的主要因素之一，与罗火林等（2016）研究结论一致。本研究的PR2-plot和ENC-plot分析结果均表明，楸树叶绿体基因组密码子的使用偏性主要受选择压力的影响较大，而受其他因素（如碱基突变等）的影响相对较小，与云南蓝果树（Nyssa yunnanensis W. C. Yin）（原晓龙等，2020a）、灰毛浆果楝（C. cinerascens （Pellegr.） H. -M.）（原晓龙等，2020b）和西南桦（Betula alnoides Hamilton）（原晓龙等，2020c）等研究结果一致，但与水稻（Oryza sativa Linn.）（刘庆坡和薛庆中，2004）研究结果不一致。结论存在差异可能因为基因表达程度和密码子碱基组成不同所引起。由此可知，物种的叶绿体基因组密码子使用偏性的影响因素众多，且不同物种的影响因素各不相同（傅建敏等，2017）。今后应基于本研究结果对楸树叶绿体功能基因的进化产生是否受选择压力影响进行深入研究。

4 结论

楸树叶绿体基因组密码子偏性较弱，偏好使用A或U结尾的密码子，主要受选择压力的影响，受突变等其他因素影响较弱。

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（责任编辑 陈 燕）