1株猫杯状病毒的分离鉴定及其ORF2序列的遗传演化分析

李鑫，杨德全，葛菲菲，沈海潇，刘健，鞠厚斌，王建，赵洪进

(上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103)

猫杯状病毒(feline calicivirus，FCV)是猫科动物中广泛传播的病原之一，易感猫常因接触病猫或其分泌物、排泄物及被污染的笼具等而发病，临床出现口腔溃疡、鼻-结膜炎、跛行、流产和肺炎等症状，严重的甚至可导致死亡。此外，有研究表明，FCV在临床健康猫中带毒率也较高，临床健康猫呈持续感染状态，这就有利于病毒在猫群中的传播，导致病毒发生变异，产生致死性毒株[1]。由于猫杯状病毒变异程度高，不同毒株间差异较大，现有的疫苗免疫保护效果并不理想。

FCV核酸类型为单股正链RNA，含有3个开放阅读框(open reading frames，ORFs)，即ORF1、ORF2和ORF3。ORF1编码病毒的非结构蛋白；ORF2编码衣壳蛋白，为病毒的主要结构蛋白；ORF3编码一个较小的结构蛋白。ORF2可分为A～F 6个区域，其中A区经蛋白酶切割形成成熟的衣壳蛋白，E区含有主要B细胞表位[2]。

FCV对猫肾细胞(CRFK，F81)、犬肾细胞(MDCK)等多种细胞敏感[1,3-4]，病毒在细胞上可获得较高的病毒滴度。本研究从发病宠物猫的鼻拭子中，用F81细胞分离获得1株FCV，并进行了全基因组扩增和序列测定，对其ORF2基因进行比较与分析，为研究FCV的分子生物学和将来疫苗株的研发提供了参考和依据。

1 材料与方法

1.1 样品

猫鼻拭子样品采集自上海某宠物医院的发病宠物猫。该病猫为雌性狸花猫，2月龄，未进行疫苗免疫，主要症状为口炎。

1.2 细胞和主要试剂

F81细胞，购自北纳创联生物科技有限公司；RNA提取试剂盒，购自Magen公司；猫杯状病毒荧光RT-PCR检测试剂盒，购自书扁科技(上海)有限公司；AMV 反转录酶等试剂，购自宝生物(大连)工程公司；引物由上海派森诺生物科技股份有限公司合成。

1.3 病毒分离

将鼻拭子样品经0.22 μm滤器过滤除菌后，接种于F81单层细胞，培养箱中孵育1 h，补液后将细胞瓶置于37 ℃、5% CO2培养箱中继续培养，观察细胞病变。当细胞病变达到80%以上时，收获细胞液，并进行荧光RT-PCR鉴定。

1.4 电镜观察

将收获的细胞液冻融3次后，10 000 r/min离心1 h，除去细胞碎片，随后上清液与终浓度为10%的聚乙二醇8000(PEG8000)混合过夜。在4 ℃下12 000 r/min离心2 h后，用Tris缓冲盐溶液(TBS)重悬。经2%磷钨酸负染后，进行透射电镜观察[5]。

1.5 病毒RNA提取及RT-PCR扩增

根据RNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA，并进行全基因序列的扩增。引物参考GenBank中已知的FCV全基因序列以及参考文献[4]进行设计(表1)。PCR反应条件如下：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物送上海派森诺生物科技股份有限公司测序。

表1 全基因扩增引物序列

1.6 全基因测序及ORF2基因分析

将测回的序列在NCBI(BLAST，http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)上进行检索确认，用Lasergene 7.1软件中的Seqman进行拼接，并登录至GenBank(登录号：MT239579)。将所测FCV的ORF2基因序列分别与 GenBank中收录的国内外参考序列进行比对，用 Megalign、MEGA 6.0等软件绘制遗传进化树。

2 结果与分析

2.1 病毒分离

正常的F81细胞呈梭形，细胞间紧密排列，接种鼻拭子样品后，24 h出现细胞皱缩、变圆、脱落，呈葡萄串样病变。取上清，经猫杯状病毒荧光RT-PCR试剂盒鉴定为FCV阳性。将该分离株命名为SH1。继续在细胞上传代2次，均在24 h左右出现细胞病变。各代次的病毒滴度分别为10-8.8、10-8.0和10-9.3TCID50/mL。

2.2 电镜观察

FCV-SH1株的F81细胞培养物经电镜观察，发现病毒粒子呈球形，无囊膜，大小35～40 nm(图1)，符合FCV的形态特征。

图1 分离株的电镜观察

2.3 病毒全基因组扩增

用表1中3对引物对FCV-SH1进行RT-PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳后，可以观察到约2 400、2 900和2 400 bp左右的3个条带(图2)，与预期相符。

2.4 ORF2基因同源性分析

FCV-SH1株ORF2序列与GenBank中登录的29株国内外参考毒株的ORF2序列进行了同源性比较与分析。结果显示，FCV-SH1株与其他各毒株的核苷酸同源性为74.1%～79.7%，与中国HRB-SS株的同源性最高，与中国SH株同源性最低；氨基酸同源性为84.5%～90.9%，与美国Urbana株同源性最高，与中国FB-NJ-13同源性最低。与疫苗株F9、F4、225和2024的核苷酸同源性为76.8%～77.7%，氨基酸同源性为86.5%～88.3%。

M. DL15000 DNA分子量标准；1. P1/P2引物扩增产物；2. P3/P4引物扩增产物；3. P5/P6引物扩增产物

2.5 ORF2基因的遗传演化及部分位点分析

本研究将分离株与29株国内外流行株的衣壳蛋白基因(ORF2)进行了序列分析，并绘制了核苷酸和氨基酸遗传进化树(图3)。结果显示，30株FCV毒株可以分为2个大分支，即基因群Ⅰ和Ⅱ，核苷酸和氨基酸序列遗传进化树是一致的，分离株属于基因群Ⅰ。从核苷酸序列进化树(图3A)可以看出，分离株与中国HRB-SS株和新西兰KCD株同属一个小分支；在氨基酸序列进化树(图3B)中，分离株与美国Urbana株在同一小分支上。分离株所属大分支上为来自国内和其他国家的不同分离株，说明FCV的分布可能无明显的地域性差异。

ORF2可分为A～F 6个区域，分析其中B～F区370～580氨基酸发现，基因群Ⅰ和Ⅱ主要存在3个氨基酸残基的差异，即377、539和557位氨基酸。如表2所示，基因群Ⅰ分别为天冬酰胺(Asn，N)、丙氨酸(Ala，A)、甘氨酸(Gly，G)，而基因群Ⅱ分别为赖氨酸(Lys，K)、缬氨酸(Val，V)、丝氨酸(Ser，S)。

▲本试验分离株FCV-SH1；●疫苗株

表2 猫杯状病毒ORF2基因群Ⅰ和Ⅱ的氨基酸序列分析

3 讨论

FCV主要引起家猫出现急性或慢性上呼吸道疾病，而且有许多猫是无症状的携带者[1]，使得病毒在猫群中广泛传播。1998年以来，美国及欧洲报道了多例与FCV感染相关的严重全身性疾病(virulent systemic disease，VSD)[6-10]。VSD FCV毒株能导致受感染的猫面部和四肢浮肿、高烧、黄疸、胰腺炎和出血等，死亡率高达60%，即使是接种了疫苗的猫也有可能会发生感染[7]，这使本病的防控面临很大的挑战。

ORF2基因编码衣壳蛋白，ORF2序列的比较分析可用于阐明不同FCV毒株之间的进化关系[11-12]。本研究选取了29株来自美国、英国、德国、日本、韩国等国家的毒株，与分离株进行了ORF2基因的同源性、遗传演化关系及部分位点的分析。本分离株与分离自犬的213/95株的核苷酸与氨基酸同源性分别为78.0%和88.8%；与分离自猎豹的V276株、GD株和SH株的同源性分别为76.6%，75.3%，74.1%和87.7%，85.7%，84.6%，说明不同宿主的FCV分离株差异性不明显。从遗传演化关系来看，分离株与美国Urbana株、新西兰KCD株等其他不同国家的毒株在同一分支，且关系相对较近，说明基因群Ⅰ的FCV分布无明显的地域性。基因群Ⅱ主要是来自中国和日本的毒株，这可能是中国和日本特有的，由于所选毒株数量有限，还需要进一步验证。疫苗株都是属于基因群Ⅱ，可能是目前免疫效果不理想的原因之一。

Sato等[13]报道基因群Ⅰ和Ⅱ在ORF2的B、F区有4个氨基酸位点的差异，即377、539、557和566位氨基酸。基因群Ⅰ分别为Asn或Asp(N或D)，Ala或Pro(A或P)，Gly(G)，Phe或Leu(F或L)，而基因群Ⅱ分别为Lys(K)，Val(V)，Ser(S)，Tyr(Y)。本研究中基因群Ⅰ和Ⅱ仅在377、539、557位点表现出一致性的差异，分别为N、A、G和K、V、S；566位点处的氨基酸残基在基因群Ⅰ和Ⅱ中都为F或Y，没有表现出特征性差异，与Sato等[13]的报道不一致，但与Sun等[14]的报道一致。而这3个氨基酸位点的差异是否对毒株的毒力、致病性等有影响还需要后续深入研究。

FCV抗原变异性很强[15]，这意味着没有疫苗能中和所有的病毒株，导致当前疫苗免疫很难起到有效的保护。因此，加强FCV的监测，分离更多毒株，并了解其分子生物学特性，能够为今后筛选疫苗候选株和研发具有较好交叉保护性的疫苗提供科学参考。