榆叶粗提液治疗幼鼠癫痫作用初探*

孔淑贞, 程璐瑶, 曾小航

(重庆工商大学 a.环境与资源学院 b.重庆高校天然药物研究重点实验室，重庆 400067)

0 引 言

癫痫(Epilepsy)，又名“羊痫风”，是一种常见的中枢性神经系统疾病，其临床多表现为短暂性意识丧失、肢体痉挛抽搐等行为，具有反复发作，久治难愈等特点[1-2]。70%的癫痫患者可以通过药物治疗方式控制，但是还有部分癫痫患者治疗效果不佳称之为难治性癫痫。目前临床上常用的抗癫痫药物有托吡酯、拉莫三嗪、左乙拉西坦等，长期服用这些药物可能会引起一系列中枢神经症状，如嗜睡、困倦、记忆丢失和注意力不集中等，以及会引起血小板降低、对肝肾功能造成损害等毒副作用[3]。

临床上近年来越来越多采用中西医结合的方法控制癫痫疾病的发作。中医理论认为癫痫多为风、火、痰、瘀等病因所致，治疗时多选用具有清肝泻火、涤痰开窍、健脾化痰、宁心安神等功用的方药[4]。采用中药方剂治疗癫痫的历史悠久，定痫熄风药、柴贝止痫汤等方剂对癫痫有较好的治疗作用，与西药治疗相比不良反应较少[5-7]。

《普济方》卷二百五十七，食治门中记载，榆叶，味甘平滑无毒，主小儿痫，小便不利，伤暑冷服。从典籍中可知，榆叶可能对癫痫疾病具有一定的治疗作用。因此采用现代医学方法建立癫痫动物模型验证榆叶在癫痫中的治疗作用，为榆叶在中药方剂中的使用提供理论依据。

1 实验材料和方法

1.1 实验动物

健康幼年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重50～100 g，由腾鑫生物技术公司提供。随机分为6组，正常对照组、PTZ癫痫模型组、阳性药物组、高、中、低榆叶粗提液组每组5只。所有动物均自由饮食，保持恒定室温在20±2 ℃，12:12 h昼夜循环光照。

戊四唑(PTZ)，来自于Tocris公司。苏木素和伊红来自中杉金桥生物技术有限公司。榆叶采自山西省运城市。

1.2 榆叶粗提液制备

称取干燥的榆叶54 g，加适量自来水在不锈钢锅浸泡30 min后放在电磁炉上煎煮3次，合并3次的过滤液，蒸发浓缩直至滤液体积约为160-170 mL。量取滤液实际体积，计算滤液浓度，取3份分别加蒸馏水稀释至0.075 g/mL、0.15 g/mL、0.3 g/mL。

1.3 癫痫模型制备

末次灌胃给药1 h后按85 mg/kg腹腔注射戊四氮(PTZ)溶液点燃癫痫幼鼠，观察各组动物行为学的变化，并依照Racine评分标准对其癫痫发作程度进行分级评价。Racine评分标准[8]如下:

Ⅰ:咀嚼、眨眼、立须、耳动、流涎、面部抽搐；

Ⅱ:点头运动、湿狗样抖动、颈部抽搐；

Ⅲ:单侧肢体抽搐；

Ⅳ:双侧肢体抽搐的同时伴随出现站立、全身僵直;

Ⅴ:在Ⅳ的基础上失去平衡，出现摔倒、身体完全、强直。

1.4 取材及冰冻切片

行为学实验结束后，所有实验动物使用3%戊巴比妥钠溶液麻醉后，打开胸腔暴露心脏，通过灌注冰生理盐水进入左心室将动物体内血液冲掉，继续灌注4%多聚甲醛进行内固定至大鼠四肢、尾巴变硬。之后断头取脑组织，从视交叉那里做横切片取尾端部分。4%多聚甲醛后固定48 h后，梯度蔗糖溶液脱水，先用10%蔗糖PB缓冲液脱水5 h，之后20%蔗糖PB缓冲液脱水5 h，最后移入30%蔗糖PB缓冲液内至脱水沉底。将脑组织从蔗糖缓冲液中取出分别放入包埋模具内用OCT进行包埋。莱卡冰冻切片机进行切片，片厚10 μm，从海马结构刚开始出现时开始取片，每5片取1片。

1.5 HE染色

间隔取片进行HE染色，每只动物染色5片。切片置于55 ℃烘箱中1 h，后于室温复温20 min。梯度酒精复水，无水酒精、95%酒精和70%酒精分别10 min，蒸馏水10 min，0.5% Triton X-100 1 h破膜，TBS缓冲液5 min润洗3次，苏木素8 min，1%的盐酸酒精2 s，自来水20 min返蓝，伊红30 s，烘干后中性塑胶封片。

1.6 显微镜观察与图像分析

Nikon显微镜观察HE染色切片并进行拍照，对海马CA1和CA3区神经元数目进行计数。

1.7 数据处理与统计学分析

所有实验数据以均数±标准误的形式表示，数据通过SPSS16.0进行统计分析，采用单因素方差分析，组间差异采用样本t检验，P<0.05认为有统计学意义。

2 实验结果

2.1 榆叶粗提液制备

采摘新鲜的榆树叶，晾干剪碎，称取一定量的榆叶于不锈钢锅中，加适量自来水浸泡30 min后在电磁炉上煎煮，先大火煮沸，再转至小火微沸煎煮，共煎煮3次，每次30 min，中间间隔10 min，每次煎煮完毕后过滤出药液，再加水煎煮第2次，再次过滤，最终合并3次的滤液即为最终的药物粗提液。在预实验中发现，榆叶粗提液在浓缩至大概130～150 mL时开始变成膏状物，由于膏状物在称取、转移等过程中易损耗过多，导致计量浓度不准确，且粗提液在转变为膏状物时其成分也可能发生破坏或转变，因此应避免膏状物的产生，将体积控制在 150 mL 以上。榆叶的用量为54 g，实验中量取浓缩的粗提液体积为160 mL，则粗提液相当于原料浓度为 0.337 5 g/mL，加蒸馏水稀释至相应浓度使用,见图1。

图1 榆叶粗提液的制备Fig. 1 Elm leaf crude extract prearation

2.2 榆叶干预后对PTZ诱发大鼠癫痫行为发作的影响

正常对照组的大鼠，未给予药物干预前会出现洗脸、探索等自由探索行为。灌胃给药生理盐水后，大鼠行为未出现较大变化，只出现探索行为无明显异常。PTZ癫痫模型组注射致痫物PTZ后多数大鼠在1 min左右出现明显的痫样行为，开始表现为Racine评分较低的流涎、面部抽搐、眨眼、点头运动、颈部抽搐等行为，之后发作行为加剧，会出现单侧肢体抽搐等行为，甚至出现Racine评分Ⅳ、Ⅴ级的双侧肢体抽搐、全身僵直、跳跃等的癫痫大发作行为，甚至有少数大鼠在给药后由于发作过于激烈而死亡。0.6 g/kg、1.2 g/kg的榆叶低、中剂量组的大鼠在注射PTZ后癫痫行为发作与模型组相似，依旧出现比较明显的癫痫行为。2.4 g/kg榆叶高剂量组的部分大鼠，PTZ诱发的癫痫行为得到了抑制，仅表现为点头、颈部抽搐等低级别的行为(图2)，高剂量榆叶粗提物对PTZ诱发癫痫行为严重程度有一定的抑制作用，可以减轻癫痫发作的严重程度。出现Ⅳ级及以上癫痫行为发作即为成功的癫痫动物模型。对癫痫行为进行统计发现，正常对照组大鼠无明显癫痫样行为出现，因此该组癫痫发生率为0。在腹腔注射PTZ后，PTZ癫痫模型组大量幼鼠出现明显的癫痫行为发作，癫痫发生率达到83%。在给予榆叶粗提物干预后，癫痫行为得到部分缓解，尤其是榆叶粗提物高浓度组癫痫发生率为60%，比PTZ癫痫组下降了20%，阳性药物组癫痫发生率为80%，因此在高浓度榆叶粗提物的干预下较好的降低了癫痫的发生率。

图2 榆叶粗提物干预后对PTZ诱发大鼠癫痫行为发作率的影响Fig. 2 The effect of elm extract on PTZ induced seizure behavior of rats

2.3 榆叶干预后对PTZ诱发大鼠海马神经元数目的影响

如图3所示，经HE染色处理后，在显微镜下可以观察到海马CA1、CA3区细胞核被染为蓝色，细胞浆被染为红色，细胞形态清晰。正常对照组大鼠脑片上的神经元细胞较为密集，神经元排列整齐有序，神经元形态呈现锥形。PTZ模型组相比对照组细胞分布明显疏松，部分神经元形态出现异常，说明PTZ诱发癫痫发作后可能会引起脑内海马神经元的损伤而导致海马CA1、CA3区神经元数目减少。在给予榆叶粗提物干预后，榆叶中、高组与PTZ模型组相比，榆叶中、高浓度组其细胞数目明显增加，分布相对密集，可能说明榆叶、阳性药干预后对PTZ点燃癫痫模型而导致的海马神经元CA1、CA3区神经元损伤有一定的保护作用。榆叶中、高浓度组海马神经元的排列及密度与阳性药组相似。

图3 榆叶粗提物干预后对PTZ诱发癫痫大鼠海马神经元影响(HE染色)Fig. 3 The effect of elm extract on hippocampus neurons of PTZ induced seizure rats

(a) CA1

(b) CA3

3 讨 论

癫痫疾病是常见的中枢神经系统疾病，在中医学中称之为“痫病”。痫病的中医治疗历史悠久，《黄帝内经》就有关于癫痫疾病的记载。在中医学领域中主要有3种常见的临床分型:肝风痰浊型、肝肾阴虚型和淤阻脑络型。小儿癫痫主要由于脾虚且痰伏，痰浊，因此小儿癫痫患者会出现肝脾功能失调、气血瘀滞等症状。小儿癫痫的中医治疗主要针对脾虚、痰浊等表现，临床上常会采用中医中药疗法消痰平风、扶正抗痫、健脾补肾等来进行小儿癫痫的治疗以减少痫症发作、降低惊厥发生。在小儿癫痫的治疗中，针对不同的痫症表现及中医分型，根据小儿癫痫疾病的不同发作时期，辨证论治采用不同的方剂进行治疗。近年来有更多的研究从中药单体中提取活性成分如松果菊苷、天麻素、黄莲素等，减少大脑内炎性因子的表达、抑制小胶质细胞增生、活化以及调节神经递质的释放，保护神经元减少癫痫的发作[9-12]。

榆树，为落叶乔木植物，分布于东北，华北，华东等地区，长江以南多栽培，其药用价值非常广泛，可用于安神、利便，治疗水肿、暑热困闷等症状。虽然有现代医学有研究发现榆叶中含有丰富的叶黄素、微量元素和三萜类化合物等，有益于提高人体的免疫力、抑制脂肪形成等作用[13-15]。，樊金玲[13]在研究榆叶叶黄素的降解动力学时提到，新鲜的榆树叶子中叶黄素含量较高，可用作营养强化剂。胡雪原[14]等对榆钱的微量元素进行了测定与价值分析，发现榆钱含有丰富的Fe、Zn、Cu、Mn等对人体有益的微量元素，其中Fe和Zn的含量最高，Fe参与人体内血红蛋白、肌红蛋白等细胞的合成，缺Zn会导致免疫力低下、食欲不振等，因此，将榆钱用作药用或食用，对人体都十分有益。此外对榆树的提取物的相关研究中，榆树提取物UD可以直接刺激成骨细胞的细胞增殖分化，说明其对骨细胞中的骨抗再吸收作用是有效的[16]；提取物UP含有至少4种不同的三萜类化合物，可以抑制3T3-L1细胞中脂肪形成，UP提取物可以通过控制细胞周期进程和下调脂肪形成基因表达来有效减弱脂肪生成[15]。同属榆属科的大果榆，多被用于治疗泌尿系统疾病，后有研究发现，其可以有效抑制前列腺细胞的增殖并促进其凋亡，表明其很有希望可以发展为治疗前列腺疾病的有效药物[17]。

PTZ是一种中枢兴奋药，能够引起实验动物迅速出现癫痫行为引起癫痫发作，是一种常用的经典癫痫动物模型。研究通过腹腔注射PTZ建立幼鼠癫痫动物模型，PTZ诱发的癫痫大鼠发作时，会出现流涎、频繁眼睛眨动、前肢后肢抽搐、跳跃或全身强直等行为。在中医学领域中，PTZ诱发的癫痫行为发作属于肝风痰浊型或淤阻脑络型。榆叶粗提物是否能够对PTZ诱发幼鼠癫痫行为有改善作用呢？研究采用灌胃方式给予PTZ幼鼠癫痫模型榆叶粗提物，通过行为学观察和组织学染色，检验给予榆叶粗提物后对PTZ建立的幼鼠癫痫模型大鼠影响。研究首次运用现代医学的方法对天然植物榆叶对癫痫疾病的治疗作用进行了验证。

实验结果显示正常状态的大鼠，仅有洗脸、探索等自由活动行为，注射PTZ点燃癫痫模型的大鼠会出现面部抽搐、点头，甚至四肢抽搐、全身僵直等Racine评分Ⅳ、Ⅴ级的癫痫大发作行为。组织学染色显示，癫痫的发作会引起海马CA1、CA3区的神经元细胞数目减少。PTZ癫痫模型不仅出现了明显的癫痫行为，HE染色显示PTZ癫痫模型大鼠的CA1、CA3区神经元数目有明显的减少，这说明在PTZ诱导后，能够导致大鼠癫痫行为的发作，且对海马神经元细胞有一定损伤，引起神经元细胞数目的减少。当能量耗竭或细胞内环境紊乱后，造成神经元受损、细胞凋亡，引起点燃。针对PTZ幼鼠模型这种脾虚、痰浊的表现，研究灌胃给予榆叶粗提物以消痰平风、扶正抗痫。在给予榆叶粗提物干预后，癫痫动物无论是癫痫行为发作还是神经元损伤方面均有较好的改善。榆叶粗提物不仅降低了癫痫发作行为的级别，而且高剂量的榆叶粗提物干预将癫痫模型的发生率降低了20%，对癫痫行为的发作有一定的抑制作用。因此，榆叶粗提物对幼鼠癫痫行为的发作有一定的改善作用

通过HE染色对海马神经元损伤进行检测发现，中、高剂量的榆叶粗提液干预较为明显的抑制了癫痫导致的海马CA1区神经元数目减少，中高剂量的榆叶干预对癫痫导致的海马CA3区神经元数目减少也有一定的抑制作用。组织学染色结果表明在给予榆叶粗提液干预后，榆叶粗提液中的有效成分可能对海马神经元有一定的保护作用，减少癫痫发作对神经元损伤引起的凋亡，从而降低了癫痫行为发作。

痫症以突然扑倒、昏不识人、口吐涎沫、肢体抽搐等症状为特征。虽然古籍有记载榆叶主小儿痫但一直无现代医学证明。PTZ癫痫幼鼠出现流涎、眨眼、颈部肌肉抽搐、肢体抽搐等症状，属于中医中脾虚、痰浊的表现。研究通过动物行为学观察及组织学染色等方法揭示了中高浓度的榆叶粗提液对PTZ诱发的癫痫行为有一定的改善作用，可以抑制癫痫导致的海马神经元数目减少，可以通过对海马神经元的保护作用来发挥对癫痫幼鼠脾虚、痰浊的治疗作用。实验对古籍中记载的榆叶功效通过现代医学的方法进行了验证，验证了榆叶粗提液对幼鼠癫痫有一定的治疗作用，可以减轻幼鼠癫痫行为的严重程度、降低幼鼠癫痫的发生率，减弱癫痫幼鼠海马神经元免受癫痫样放电引起的损伤。因此研究发现中高浓度榆叶粗提液对幼鼠癫痫的治疗作用，对进一步开发新的癫痫治疗药物提供了实验依据和新的药物开发方向。

4 展 望

癫痫在中医学中称之为“痫病”，在很多医书中都有关于痫病发作及治疗的记载，最早可以追溯到战国秦汉阶段，《五十二病方》和《黄帝内经》均有痫病治疗方剂、方法的记录。最近二十年来，传统中医学结合现代医学进行癫痫的治疗案例越来越多。关于中医认为痫病发作多由痰、风、淤所致。针对不同的致病原因、症状表现及癫痫发病的阶段，采用辨证论治采用不同的方剂进行治疗，在发作期以疏肝理气、祛痰开窍为主，缓解期当扶正祛邪进行治疗。治疗癫痫常用的方剂有定风汤、止痫汤、息风胶囊等[18-21]，可以减少癫痫棘波的发放，减轻癫痫行为的症状及发生频率，降低持续时间，有效率可以达到50%～98%。近年来更多的研究发现中药中的有效活性成分在治疗癫痫疾病中发挥了非常重要的作用，可以改善神经递质失衡，修复受损的离子通道和神经元，减轻胶质细胞激活、增生，减轻炎症反应，并具有较好的抗氧化活性。除此之外，胡椒中提取的胡椒碱[22]、东亚钳蝎中提取的蝎毒素BmK IM[23]、黑种草里提取到的百里香醌[24]可以降低炎症因子的表达、减少兴奋性递质的释放、抗氧化等作用，从而改善癫痫行为发作、发挥对癫痫的治疗作用。近年来越来越多的研究倾向于在传统中药中提取有效的活性成分用于癫痫疾病的治疗研究，开发新的癫痫疾病的治疗药物。

榆叶其药用价值非常广泛，可用于安神、利便，治疗水肿、暑热困闷等症状。古籍记载榆叶主小儿痫，因此研究通过行为学观察和组织学实验对榆叶在癫痫治疗中的作用进行了研究。但是研究仅对榆叶中治疗幼鼠癫痫模型的作用进行了初探，虽然显示出了一定的抑制癫痫行为和改善神经元的作用，但是具体是哪些有效成分起作用仍不清楚。榆叶中含有丰富的叶黄素、微量元素和三萜类化合物等，虽然有研究发现这些活性成分有提高免疫力、治疗泌尿系统疾病的作用，但不清楚究竟是否叶黄素或三萜类化合物也发挥了抗癫痫的作用。而且癫痫发作的机制非常复杂[25]，可能是兴奋性神经递质系统占优势引起，也有可能是抑制性神经递质系统受损造成的。在癫痫发生后，继而会引起小胶质细胞和星形胶质细胞的激活、增生等炎症反应。榆叶粗提物在发挥对癫痫行为的改善作用时是否通过干预了神经递质系统的平衡或者减轻了胶质细胞的炎症反应也不清楚。在未来的研究中，一方面可以对榆叶天然活性成分进行提取分离，并进行每种活性成分的药效学作用研究，以寻找新的治疗小儿癫痫的有效活性成分。另外，也需要对榆叶提取物的作用机制进行进一步的研究和探索，才能更好地发挥榆叶粗提物在癫痫疾病中的应用。