高温高压膨化法降解小麦中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及降解产物解析的研究

胡学春 任凌云 王丽娟 王 骏 张艳侠 金增伟 吴真真 王瑞杰 郭启雷

(山东省粮油检测中心1 ，济南 250101) (山西粮食质量监测中心 2 ，太原 030024) (山东省食品药品检验研究院 3 ,济南 250101) (安捷伦科技(中国)有限公司 4 ,北京 100102)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇是由镰刀菌产生的单端孢族化合物中的一种，属于ß类单端孢霉烯族毒素，是一种有毒的次级代谢产物[1]，因动物食后呕吐，又名呕吐毒素。

小麦在生长期、成熟期和收获期，都可感染呕吐毒素。镰刀菌能在1～39 ℃的温度范围内生长，最适温度为25～30 ℃，最适产毒温度通常在8～12 ℃之间。土壤几乎包含了自然界所有菌类，我国高产量的方法之一是密集种植，阳光不能照射土壤杀死其中的真菌，当遇到阴雨连绵，温度湿度适宜时，土壤中的真菌快速繁殖，小麦通过根系把土壤中的真菌吸收进入果实。在成熟期，小麦果壳张开，尤其是在淮河流域，此时正是梅雨季节，雨水进入籽粒果壳内，果壳降温收缩闭合，包含住雨水，此时温度高、湿度大，小麦籽粒特别容易感染真菌。在收获期，粮食籽粒特别是在胚芽部，此处水分大、富含糖、脂肪和蛋白质，是真菌的良好培养基，适宜真菌的快速生长。

图1 DON分子结构式

2006年，欧盟规定呕吐毒素在粗谷物中的最大限最为1 250 μg/kg[2]。2001年食品添加剂联合专家委员会(JECFA)第56次会议首次对DON进行了评估，根据毒理学实验结果，JECFA提出DON的暂定每日最大耐受摄入量( provisional maximum tolerable daily in-take，PMTDI)为1 μg/kgbw。2010年JECFA第72次会议维持了DON的PMTDI值为1 μg/kgbw[3,4]。GB 2761—2017中规定小麦及其制品中DON的最大允许限量为1 000 μg/kg[5]。

目前，国内研究小麦(粮食)中DON降解的主要方法有风选除去赤霉病粒、紫外线照射法；臭氧水浸泡法降解赤霉病小麦中的 DON[6]，DON的降解率可达19.99%，增大浓度、延长浸泡时间，降解率最大可到44.12%；生物发酵法降解粮食及其制品中真菌毒素[7]，酒糟降解后DON的含量≤500 μg/kg，还有蒙脱石物理吸附法、氨发酵法等。

本研究分析了小麦中DON的降解方法及降解产物，感染DON的小麦经高温高压膨化处理，不添加任何化学试剂，可使DON降解率达61.9%～81.1%，降解产物经UHPLC-QTOF-MS分析，通过全扫描模式采集数据，利用设备配置的粒子群优化算法(Particle Swarm optimization, PSO)，对不同质核比范围内分段优化，考虑同位素权重计算精确质量数，利用分子式生成(MFG)功能生成元素组成，通过二级质谱图检索比对谱库(PCDL库)，与谱库已知化合物分析确认降解产物的分子式，根据DON的已知结构和化学键能推测可能的分解产物，通过仪器内置的结构解析辅助软件(MSC)，对未知结构进行推断，得到至少5个分解产物，确定降解产物可能的分子结构，降解产物之一3-epi-DON的毒性是DON的1/350[6]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

污染DON不同程度的小麦 ，1#小麦DON含量731 μg/kg、2#小麦DON含量8 995 μg/kg、3#小麦DON含量4 023 μg/kg；DON标准物质，5 mg，纯度98.0%；DON参考标准物质，Lot # D-C-622，含量1 900 μg/kg；甲醇、乙腈，色谱纯。

1.1.2 仪器与设备

膨化罐：304不锈钢，自制(见图2)；Waters e2695高效液相色谱仪，UHPLC-QTOF-MS 6545高效液相色谱-飞行时间串联质谱仪。

1.2 方法

1.2.1 润麦

取500 g小麦于润麦瓶中，加入水至实验要求的水分，充分混合均匀，密闭放置24 h，使水被小麦完全吸收。

加水量按公式(1)计算：

w水=w样(m1-m0)/(100-m1)

(1)

式中：w水为需要加水数量/g；w样为实验样品的数量/g；m1为样品需要加到的水分/%；m0为样品原始水分/%。

1.2.2 小麦中DON的降解脱毒处理

实验用膨化机膨化腔2.5 L，转速30 r/min和60 r/min 2挡可以选择，煤气加热，设计最高使用压力1.3 MPa。

将1.2.1润麦处理后的小麦300 g置于高温高压膨化机中，在不同水分、压力下膨化处理，控制加热时间和转速，使膨化腔达到规定的压力后，启动泄压开关，达到膨化的目的，冷却至室温后粉碎，粉碎后的样品检测其DON含量，确定降解脱毒的最佳实验条件。

1.2.3 DON 标准物质降解实验

将5 mg DON 标准物质溶解于1 mL乙腈中，并稀释成500 μg /mL 的DON标准溶液，将膨化罐置于烘箱中加热至80 ℃，把1 mL DON乙腈标准溶液滴加到膨化罐内部，使乙腈自然挥发干，将膨化罐置于高温高压膨化机中，按1.2.2确定的最佳条件随同样品一起膨化处理。

图2 膨化罐结构示意图(单位mm)

1.2.4 检测方法

1.2.4.1 按照GB 5009.111—2016《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法测定小麦降解脱毒处理前后的DON含量。

1.2.4.2 按照 LS/T 6113—2015《粮食中脱氧雪腐镰刀菌烯醇测定 胶体金快速定量法》测定小麦降解脱毒处理前后的DON含量。

1.2.4.3 高效液相色谱-飞行时间串联质谱仪解析DON降解产物

UHPLC-QTOF-MS实验条件为，液相色谱柱: Agilent Eclipse Plus C18(RRHD)(柱长150 mm，柱内径 3.0 mm, 填料粒径1.8μm)；流动相: A相：水溶液(0.5 mmol/L 氟化铵+ 4.5 mmol/L 甲酸铵+ 0.1% 甲酸)；B相：甲醇溶液 (0.5 mmol/L 氟化铵+ 4.5 mmol/L 甲酸铵+ 0.1% 甲酸)；梯度洗脱；流速: 0.40 mL/min；柱温: 40 ℃；进样量：10 μL；离子源: 电喷雾离子源；质量数扫描范围: 40m/z～1 000m/z(+)；40m/z～1 100m/z(-) ；干燥气温度: 300 ℃；干燥气流量: 7 L/min；雾化器压力: 40 psi；鞘气温度: 375 ℃；鞘气流量: 12 L/min；毛细管电压: 3 500 V/4 000 V；喷嘴电压: 0 V/1 000 V；采集频率：2 Spec/s。

2 结果与分析

2.1 测定结果准确度的质量控制

不同方法测定DON的结果均符合GB 5009.111—2016中25%的重复性实验要求，也达到DON参考标准物质第一范围800～1 000 μg/kg的要求，从而确定本研究对DON测定结果的可靠性。

2.2 小麦中DON降解条件选择实验

2.2.1 膨化机检漏和预热

检漏和预热：在膨化腔加入100 mL水，关闭密封阀，检查是否漏水。开启自动旋转器30 r/min、点火加热至1.3 MPa，关闭加热和旋转器，开启膨化开关。如果有漏气，检查或更换密封垫片后继续实验。

实验结果表明，膨化压力在0.7 MPa以下时，转速选择30 r/min和60 r/min均可，膨化压力在0.7 MPa以上时，应选择转速60 r/min，保证受热均匀和膨化效果。

2.2.2 水分对DON降解的影响

将2#小麦润湿至水分为15%、20%、25%，分别置于高温高压膨化机中，调整压力为0.7 MPa， 小麦降解后DON检测结果见表1。

表1 水分对降解的影响结果

实验结果表明，水分对降解脱毒效果影响不大，考虑到能耗，选择20%。

按照设想，水分的增加会有利于小麦中DON的降解。按照克拉伯龙方程PV=nRT,1 moL 水完全气化，在理想状态下的体积是22.4 L，体积膨胀1 244倍，饱和水蒸气在0.7 MPa时的温度约165 ℃，在压力P一定时，v1/T1=v2/T2，当温度从20 ℃(293 K)升高到165 ℃(438 K)时，体积增加1.5倍，即1 moL水完全气化，温度达到165 ℃时的体积膨胀1 866倍，水分体积的瞬间爆破，有可能将小麦连同DON一起撕裂，但实验结果表明，增加水分并不会提高降解效果。

2.2.3 压力对DON降解的影响

将2#小麦润湿至水分为20%，分别置于高温高压膨化机中，调整压力为0.7、1.0、1.3 MPa，小麦降解后DON检测结果见表2。

表2 压力对降解的影响结果

实验结果表明，压力是影响降解脱毒效果的关键因素，选择压力1.3 MPa。

膨化时的温度、压力是影响膨化效果的关键因素，温度是由压力确定的，所以调节压力是本实验的主要控制条件，但因本膨化机设计的最高使用压力是1.3 MPa，为安全计只能使用到最高设计压力。增加压力即提高温度，分子获得足够能量，化学键断裂，说明在高温高压下瞬间爆破使化学键获得足够的能量是DON降解的必要条件。

2.2.4 小麦中DON降解的重复性实验

将1#、2#、3#小麦润湿至水分为20%，置于高温高压膨化机中，在1.3 MPa压力下，在不同时间进行重复性实验，在不同的实验室测定其原料和处理后产品的DON含量，结果见表3。

实验结果表明，在一年内不同时间，对不同DON含量的小麦进行降解实验，降解率在61.9%～81.1%，平均75.2%，说明本方法对于污染不同浓度DON的小麦降解脱除效果是可重复实现的，方法是可靠的。降解率的差异，应该是样品检测及实验参数的差异引起的，而不是方法的不稳定引起的。

表3 DON重复性实验的结果表

2.3 DON标准物质的降解脱毒处理及其降解产物的分析

2.3.1 DON标准物质的降解脱毒处理

将1.2.3处理的膨化罐随小麦在压力为1.3 MPa时膨化处理，然后将膨化罐置于乙腈中浸泡清洗罐中的DON及其降解产物，浓缩后用UHPLC-QTOF-MS解析其降解产物。

2.3.2 主要降解产物的变化方式和降解产物的基本参数

根据UHPLC-QTOF-MS分析检定，解析出以下5种DON降解产物，见表4和图3。

表4 DON主要降解产物

2.3.3 DON主要降解产物的高分辨质谱图

DON降解的主要途径为DON的3-OH的β、α异构化和酮基化及内醚键的水化反应、C5、C6位基团的降解脱落等。3-OH和内醚结构是 DON的重要毒位点，3-OH的异构化和内醚键水化反应使内醚键的断裂对DON毒性的降低意义重大。

2.3.3.1 主要降解产物之一

水化-DON的保留时间和同位素分布匹配图，见图3。

图3 水化-DON的保留时间和同位素分布匹配图

图3a为水化-DON的保留时间和丰度图，图3b为水化-DON的同位素分布的理论值(方框)和实际值(方框内棒状)完美匹配，基本确定了降解产物水化-DON的分子式、分子结构式、分子质量，化学反应方程结构式如图4。

图4 DON发生水化反应生成水化-DON的反应结构方程式

杂环内醚结构是目前已知DON的重要毒位点之一，水化反应是醚键打开，结合一个H2O分子，此处分子键的断裂对毒性的降低意义重大。 此处化学键的断裂，意味着DON的杂环结构变成不稳定的单键连接，猜测杂环结构完全断裂的可能性极大。

2.3.3.2 主要降解产物之二

3-epi-DON的保留时间和同位素分布匹配对比图见图5。

图5a为DON和3-epi-DON的保留时间和丰度对比图，图5b为DON和3-epi-DON的同位素分布的理论值(红框)和实际值(红框内棒状)匹配对比图，基本确定了3-epi-DON的分子式、分子结构式、分子质量。

图5 DON和3-epi-DON的保留时间和同位素分布匹配对比图

尽管3-epi-DON只是DON的3位羟基发生差向异构，是 DON的同分异构体，与DON的分子式、分子质量、质核比一样，但二者的分子结构式不同，保留时间有较大差异，这也说明了二者的化学性质有较大差异，也从另一方面证明了3-epi-DON与DON的毒性有较大差异。

3 结论

污染了脱氧雪腐镰刀菌烯醇的小麦，经高温高压膨化处理，61.9%～81.1%的DON发生了降解反应，已经解析出的降解产物有水化-DON、3-epi-DON、3-kedo DON；降解机理是DON分子化学键获得足够能量发生断裂，其断裂途径主要是DON的3位羟基发生差向异构和酮基化，1位内醚发生水化反应；压力是影响降解脱毒效果的关键因素；通过UHPLC-QTOF-MS基本确定了DON部分裂解产物的分子式有C15H20O6、C15H18O6、C15H22O7，分子质量分别是296.126 0、294.110 3、314.136 6 ku。