HER-2基因表达对乳腺癌前哨淋巴结转移性质的影响分析

郭日昌，梅 林，陈凤如，黄彬华

(广东医科大学附属东莞厚街医院胸外甲状腺乳腺科，广东 东莞 523000)

乳腺癌是指人乳腺组织细胞，尤其是乳腺上皮组织细胞，发生大面积癌变的一种恶性肿瘤疾病。其发病率与致残率在女性恶性肿瘤中位居榜首，但也发生在男性中，且近几年患者发病年龄持续呈现低龄化的趋势[1-2]。乳腺癌不仅严重威胁患者的身体健康并带来焦虑、烦躁、厌世等不良心理问题，而且可能会切除患者乳房，从而为患者随后的日常生活带来不便并进一步加深患者负面情绪。在恶性肿瘤中，由于外部和内部因素的共同作用，淋巴结转移是一种常见的现象[3]。

前哨淋巴结是指原发肿瘤出现淋巴结转移时所经的首个淋巴结。作为乳腺癌细胞最容易转移的位置，其对判断该疾病的实际变化有着至关重要的作用[4-5]。同时确定前哨淋巴结无转移可以使患者避免腋窝淋巴结清扫手术(axillary lymph node dissection, ALND)，进而规避其带来的一系列手术并发症[6]。

人表皮生长因子2(human epidermal growth factor receptor 2, Her-2) 可以通过调控多条信号通路，促进细胞的生长分裂，调控细胞的生长与分化[7]。研究表明, HER-2的表达水平与肿瘤的分级、大小,淋巴结转移及药物敏感性和预后密切相关[7-8]。HER-2受体阳性乳腺癌患者占全体乳腺癌患者的25%，表现出更强的浸润性和更短的生存期。这些都提示HER-2表达水平与乳腺癌的发病和转移可能具有强相关性。

本研究通过检测2014年4月～2019年5月我院收治的乳腺癌患者原发病灶和前哨淋巴结转移灶的HER-2基因表达水平与前哨淋巴结转移水平，探究于乳腺癌前ER-2基因表达对哨淋巴结转移性质的影响情况。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2014年4月～2019年5月我院收治的乳腺癌患者96例。纳入标准：①年龄20～70岁；②首次发病，具有完整的乳腺和前哨淋巴结结构；③由主治以上级别专科医师，通过病理检查确诊为乳腺癌；④患者临床和病理资料齐全；⑤患者均为汉族女性；⑥根据《恶性肿瘤TNM分类法》和美国癌症协会 (American Joint Committee on Cancer, AJCC) 第7版乳腺癌分期标准判断肿瘤处于Ⅱ期；⑦患者意识清楚并可以通过语言或者文字表达;⑧事先告知患者检测方案并获得患者及其家属的书面同意； 排除标准:①存在严重意识障碍和严重并发症症状；②患有除乳腺癌、纤维癌和脂肪癌以外的癌症；③病理资料不全或病理分型不明确者；④根据《恶性肿瘤TNM分类法》和AJCC第7版乳腺癌分期标准判断肿瘤处于Ⅲ期或Ⅳ期；⑤患者曾被确诊为乳腺癌且接受过ALND等相应治疗，为二次或多次发病者；⑥患者具有少数民族或其他国家的血统；⑦处于妊娠或哺乳状态的患者；⑧患有严重精神疾病的患者；⑨具有严重的血液病和肝肾功能障碍者；⑩任何其他诊断治疗禁忌者；检测未获得患者及其家属的书面同意或其中途退出。

根据临床及影像学检查显示的前哨淋巴结转移情况，将患者分为三组，无转移组48例，低转移组28例，高转移组20例。无转移组、低转移组和高转移组年龄、肿瘤直径、绝经比例和平均体重等一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。详见表1。

1.2检测方法

1.2.1免疫组化法检测原病灶的HER-2基因表达：采用免疫组织化学法对乳腺癌原病灶和前哨淋巴结转移灶中的HER-2的表达状态进行检测。针吸法获得活检的乳腺癌原病灶组织标本。使用4%中性 (磷酸缓冲) 福尔马林固定液固定标本6 h后，将其石蜡包埋进行切片处理，每份切片厚度<5 μm。引用专用乳腺癌HER-2检测试剂盒(免疫组化法)，而此次研究所引用的试剂盒由广州安必平医药科技有限公司提供，并定性检测所有被选对象原病灶HER-2蛋白水平情况。其中含有抗HER-2蛋白鼠单克隆抗体、二抗I试剂、二抗II试剂、DAB色原、底物缓冲液和质控片，原理为En Vision法。步骤如下：①用二甲苯冲洗石蜡切片脱蜡2次，每次间隔30 min。100%、95%、90%、85%、80%、70%的乙醇浓度自高至低依次对组织进行复水，每次间隔5 min，随后将切片置于蒸馏水中5 min进行洗片，共进行3次。②用高压对修复组织抗原。③切片滴加PBS 冲洗3次后滴加抗HER-2蛋白鼠单克隆抗体，4℃过夜。PBS 冲洗 3 次后滴加二抗Ⅰ试剂，室温下孵育10 min。PBS冲洗3次后滴加二抗Ⅱ试剂，室温下孵育10 min， PBS 冲洗3次。④切片滴加 DAB 色原溶液显色，显色后用自来水冲洗，苏木素复染，脱水，中性树胶封固。⑤使用质控片设置阳性对照片和阴性对照片。

表1 三组患者的一般情况资料比较

1.2.2免疫组化法检测前哨淋巴结转移灶的HER-2基因表达:采用免疫组织化学法对乳腺癌前哨淋巴结转移灶中的HER-2的表达状态进行检测。用前哨淋巴结活检法获得的乳腺癌前哨淋巴结转移灶组织标本。采取与原病灶处同样的方法对低转移组和高转移组的前哨淋巴结转移灶处的HER-2蛋白进行定性检测。

1.2.3荧光原位杂交法能对移速阳性标本进行检测:根据下文提及的检测标准，对存疑的标本取其他切片使用荧光原位杂交法进行进一步检测。

1.2.3.1操作前准备:将4 μm切片于65℃下过夜烤片。 随后与免疫组化法一样将组织切片脱蜡和复水，于 50℃下用 30%[w/v]酸性亚硫酸钠(购于美国Sigma公司)处理组织切片，30 min后使用2xSSC溶液(购于天津生化制品有限公司)对切片进行漂洗。向40 ml中性2xSSC加入美国Sigma公司提供的0.4 ml蛋白酶K储存液，得到蛋白酶K工作液；在蛋白酶K工作液内浸泡组织切片，在37℃环境下孵育20～30 min。然后将切片玻片依次置于-20℃预冷的70%乙醇、85%乙醇和 100%乙醇中脱水，自然干燥玻片后置于56℃烤箱中预热待用。

1.2.3.2标本的准备：标记玻片背面的杂交区域。用2xSSC稀释为75%的甲酰胺变性液于73℃水浴箱中预热30 min后，将玻片浸泡于该变性液中5 min，充分变性。随后在零下20℃预冷的70%浓度乙醇、85%浓度乙醇和100%浓度乙醇内分别置入玻片后梯度脱水。待自然干燥后，将其置于温度在45℃的烤片机上进行预热。

1.2.3.3探针配置：将2 μl的GLP HER-2/CSP17 探针(北京金菩嘉医疗科技公司)与1 μl的去离子水和7 μl的杂交缓冲液混匀，先置于73℃水浴箱中变性5 min，再移交至45℃水浴箱中备用。

1.2.3.4样品杂交：将探针混合物滴于杂交区域后马上盖片封片，将其放置于铺有浸湿纸巾的湿盒中，密封后于42℃保温箱中过夜。

1.2.3.5洗涤样品：在恒温状态下，向3个考普林瓶内分别置入2xSSC稀释为的 50%浓度的甲酰胺溶液，然后在46℃水浴箱内放置盛有洗涤液的3个瓶子，预热30 min。将移去盖玻片的组织玻片立即置于第1个考普林瓶中，晃动玻片1～3 s，10 min后取出转至第2个考普林瓶中，相同方法洗涤后转入第3个考普林瓶中，操作相同。取出后再分别以 50 ml 2xSSC 溶液和0.1%NP-40 洗液(北京金菩嘉医疗科技公司)洗涤玻片， 置于暗处自然干燥。

1.2.3.6利用显微镜观察发现：将15 μl DAPI复染剂滴加在最终样本的杂交区域后，马上用盖玻片盖上，然后放置在阴凉地静置20 min，然后利用荧光显微镜进行观察，但在观察时应对滤波片合理选择。

1.3检测标准:将染色完毕的标本置于光学显微镜10×物镜下观察，HER-2阳性癌细胞的细胞膜完全深着色。根据2014年发布的中国乳腺癌HER-2检测指南[9]，将结果定义如下：①0：所有或>90%的肿瘤细胞完全不存在细胞膜着色；②1+为>10%的肿瘤细胞不完整浅着色；③2+为>10%的肿瘤细胞完整浅着色；④3+为>10%的肿瘤细胞完整强着色。3+可视为病灶处HER-2阳性，0～1+可视为病灶处HER-2阴性，2+需要通过荧光原位杂交法进行进一步判定。

17号染色体着丝粒显示绿色荧光信号，HER-2基因显示橘红色荧光信号。若细胞核内同时呈现绿色与橘红色荧光信号则该细胞被视为HER-2阳性细胞。调整视野，计数30个细胞中阳性细胞的比例。若比例>2.2为阳性，若比例<1.8为阴性，若处于1.8～2.2两者之间则扩大计数细胞范围，直至比例>2.2或<1.8。若此方法下阳性[2+(+)]，2+标本方可归为病灶处HER-2阳性，反之归为病灶处HER-2阴性[2+(-)]。

1.4统计学分析:所有数据运用SPSS21.0统计学软件进行统计分析。计数资料用率(%)表示，比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1原病灶的HER-2基因表达:各组原病灶的HER-2基因表达情况见表2。三组患者各档人数比例均差异有统计学意义(P<0.05)。无转移组的乳腺癌原病灶的HER-2基因阳性率(20.83%)显著低于低转移组(42.86%)与高转移组(55.00%)，差异有统计学意义(P<0.05)，且低转移组阳性率显著低于高转移组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 三组患者原病灶处的HER-2基因表达

2.2前哨淋巴结转移灶的HER-2基因表达：低转移组和高转移组前哨淋巴结转移灶的HER-2基因表达情况见表3。两组患者除1+档外，各档人数比例均差异有统计学意义(P<0.05)。低转移组患者的乳腺癌转移灶处HER-2基因阳性率为39.28%，显著低于高转移组的55%，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 低转移组和高转移组患者前哨淋巴结转移灶处的HER-2基因表达[例(%)]

2.3原病灶与前哨淋巴结转移灶处HER-2基因表达对比：低转移组与高转移组患者的乳腺癌前哨淋巴结转移灶处HER-2基因阳性率与其对应组的原病灶处阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，呈现较高的一致性。见表4。

表4 低转移组和高转移组患者原病灶与前哨淋巴结转移灶处HER-2阳性率对比[例(%)]

3 讨论

乳腺癌是女性恶性肿瘤死因的榜首，在全球范围内占全部恶性肿瘤的22%，其高发病率、高致残致死率、高复发率与低龄化发病和持续上升发病的趋势使得其成为临床研究的热点。未育、未哺乳、月经初潮较早、乳腺增生、乳腺腺体致密、物理因素、化学因素和家族遗传史等皆是罹患乳腺癌的高危因素[10]。尽管男性也可能患乳腺癌，但由于生理结构差异，其可能性远小于女性。此外，由于相关观点普及程度和社会观念影响，男性本身察觉到患癌可能并就医的可能性小。因此，男性患者人群过小，无法达到互相参照的样本量，故本次实验完全排除男性患者。研究显示，不同民族乳腺癌患者HER-2阳性率和前哨淋巴结转移率差异有统计学意义(P<0.05)[11]，考虑到患者样本量的充足性，本次实验只包含汉族患者。

乳腺癌中前哨淋巴结转移是常见现象，但并非所有的乳腺癌患者均出现转移现象。事实上，50%～70%的乳腺癌患者不出现前哨淋巴结。对无转移患者实施ALND不仅不必要，且会带来上肢水肿和运动障碍等一系列术后并发症，并破坏淋巴结的免疫检测功能，从而促进隐匿癌灶向远处转移。因此，研究影响乳腺癌前哨淋巴结转移的因素对于乳腺癌的控制病情和治愈有极高的临床意义。前哨淋巴结活检技术作为一种微创诊断技术，可以大幅避免ALND引起的相关并发症。研究证明，仅接受前哨淋巴结活检而不接受ALND的患者较接受ALND的患者而言，无病生存期和总生存期差异无统计学意义(P>0.05)，但前者具有更好的长期生活质量[12]，亦有研究证实前者具有更低的复发率。故本次实验采用前哨淋巴结活检法获取前哨淋巴结组织进行HER-2基因表达检验。

免疫组化法测量HER-2表达操作简便、成本低、得结果快，是广泛应用的理想定性检测方法。但是由于其本身操作中蛋白容易受到破话和污染，会对结果的准确性造成较高的干扰。因此对于2+的样本需要采用原位杂交法进行进一步的测定。荧光原位杂交法测量主体为HER-2 基因而非HER-2蛋白，因此具有更高的稳定性，实验操作的影响相对降低，同时，其还可用于定量检测。但是荧光原位杂交法操作繁复、成本高昂、操作流程时间过长，因此在大多数相关研究中仍主要应用于对免疫组化法存疑样本检测的补充，而非直接应用。免疫组化法仍然是测量HER-2表达的首选。

乳腺癌的具体的发病机制目前尚不清晰，仍处于研究探索阶段。但随着现代生物学的发展尚,多项研究表明,多种细胞因子及基因在乳腺癌的发生、发展和转移中起着重要作用。HER-2是坐落于17号染色体上的人类原癌基因，具有酪氨酸酶活性，可以作为多种肿瘤的调控因子，影响肿瘤的形态特点、生长方式、恶性程度、转移、复发和对内分泌治疗的敏感程度。它也被证实可以促进乳腺癌的发生和发展。HER-2阳性乳腺癌亦表现出更强的浸润性、更短的生存期和更差的预后效果。本实验显示，乳腺癌原病灶和前哨淋巴结转移灶的HER-2基因表达水平与乳腺癌前哨淋巴结转移水平正相关，提示HER-2水平可以作为良好的前哨淋巴结转移预测参数，预测其是否转移以及转移程度。国内外多项研究显示，多项乳腺癌相关受体表达量在原病灶和前哨淋巴结转移灶处的表达不一致[13]。但国内多项研究也展示了HER-2在原病灶和前哨淋巴结转移灶处的表达具有较好的一致性[11,14,15]，这与本研究结果一致。低转移组和高转移组的患者原病灶和前哨淋巴结转移灶处的表达均差异无统计学意义(P>0.05)。提示原病灶处的HER-2分子水平已经可以很好地反映前哨淋巴结转移灶处的HER-2分子水平，这对于临床研究和治疗具有重要的参考意义。

总之，本实验通过免疫组化法和荧光原位杂交法，测量不同转移性质之下的初发女性乳腺癌患者原病灶和前哨淋巴结转移灶处的HER-2水平，发现其具有良好的正相关性，且原病灶和前哨淋巴结转移灶处的HER-2水平呈现较好的一致性。这提示建立以原病灶HER-2表达水平为基础的乳腺癌前哨淋巴结转移性质预测系统具有可行性，为乳腺癌分子靶向治疗提高了较高的参考依据