紫花地丁总黄酮的抗氧化作用研究

张 琳，陈雅思

武昌理工学院 生命科学学院 (武汉 430223)

紫花地丁是很常见的天然草药，在中药中有着很重要的地位，从古至今，其清热解毒的功效人们早已熟知，现如今，其在抗氧化方面的作用得到了科学界广泛的关注。黄酮类化合物是一类天然产物，它广泛存在于植物体内，具有2-苯基色原酮结构[1]，这个特殊结构让黄酮类化合物具备有丰富多样的生物活性，如心血管系统活性、提高机体性能、抗氧化自由基、抗衰老等[2]；黄酮类活性化合物不仅能保护心血管系统，而且还有抗癌，抗病毒，治疗咳嗽、风湿、冠心病、肝脏及动脉硬化等作用[3-4]。本实验探究了紫花地丁主要成分总黄酮的体外抗氧化活性强弱。首先利用乙醇回流提取方法从紫花地丁中草药本身中提取出有效成分总黄酮，将通过氯仿和石油醚萃取后再重结晶得到的总黄酮制备成样品溶液，设定合适浓度梯度[5]，通过对比紫花地丁总黄酮对亚硝酸钠、·OH自由基和DPPH的还原能力，来检测紫花地丁总黄酮的体外抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

紫花地丁干草，云南龙发制药有限公司；芦丁标准品，合肥博美生物公司；亚硝酸钠、硝酸铝、盐酸萘乙二胺、对氨基苯磺酸、水杨酸、硫酸亚铁、75 %乙醇、95 %乙醇、无水乙醇、石油醚、氯仿、乙醚、碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、盐酸、正丁醇、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、30%过氧化氢，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

YRE-301型旋转蒸发仪、RE-201C型恒温水油浴锅、SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵、PTHW型电热套、DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；SB-3200DT超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；750T型多功能粉碎机，铂欧五金厂；BS 224 S型电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；索氏提取器，成都企航仪器制造部。

1.2 试验方法

1.2.1紫花地丁总黄酮的提取与纯化

1.2.1.1 药材前处理

将紫花地丁干草打碎，称重放置一边，架好回流装置，取粉碎后的紫花地丁干草若干，在常温下用石油醚(沸点30 ℃～60 ℃)浸泡10 min后在45 ℃恒温条件下回流30 min，以达到去酯和色素的目的，之后挥干石油醚，备用。

1.2.1.2 总黄酮的提取[6]

取10 g紫花地丁干草在80 ℃水浴条件下，以75 %的乙醇为提取剂，采用紫花地丁∶乙醇(1∶15，质量比)的料液比，回流提取2次，每次回流提取时间1 h，同时提取3组，后合并提取液，即为粗体溶液。

1.2.1.3 总黄酮的分离[7]

合并液浓缩至原体积的1/5，密封静置过夜，分3次以一层中速滤纸抽滤，以此方法除去不溶性杂质，得到粗品溶液，而后浓缩干燥得固体，称重。

1.2.1.4 总黄酮的纯化[8]

将固体打碎，分别以氯仿，石油醚浸洗1次，以去除杂质，抽滤烘干。以乙醚溶解，依次用20 mL 5% NaHCO3、5% Na2CO3、0.2 % NaOH以及4% NaOH溶液萃取，以稀盐酸调节至pH=2。 出现沉淀后，收集将各个萃取液的沉淀合并，以热水溶解后用正丁醇萃取，取有机层于蒸发皿浓缩，恒温干燥得纯化后产品。

1.2.2总黄酮含量的确定

1.2.2.1 芦丁标准曲线的绘制

先取0.5 mg/mL的芦丁标准品溶液，取6支25 mL具塞试管，分别编号1、2、3、4、5、6，再精密量取 0、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL标准溶液分别置于6支25 mL具塞试管中，再用亚硝酸钠- 硝酸铝比色法[9-12]测定其吸光度值后绘制芦丁标准曲线[13]。

其具体的步骤为：每根试管分别加2 mL的5%亚硝酸钠溶液，摇匀后静置5 min。再加2 mL10%硝酸铝溶液，同样摇匀，放置5 min。最后加1 mL 4%氢氧化钠溶液，用75%乙醇定容至15 mL，摇匀后放置 20 min。以不加芦丁标准溶液的1号试剂做为空白对照，在波510 nm 的测定吸光度A。以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度值 A 为纵坐标绘制芦丁标准曲线。

1.2.2.2 样品浓度测定方法

精密称取纯化后的总黄酮产品50 mg，用75%乙醇溶解在100 mL容量瓶中，并用75 %乙醇稀释至刻度，摇匀后再从中吸取10.0 mL，按制作标准曲线方法进行操作，测定其吸光值A，并利用芦丁标准曲线计算得总黄酮浓度，平行3次实验得平均值。总黄酮纯度计算公式如下：

1.2.3不同紫花地丁总黄酮溶液浓度对亚硝酸盐清除率的影响

取6只25 mL试管分别编号1、2、3、4、5、6，再精确量取0.5 mg/mL的亚硝酸钠标准液2.0 mL于6支25 mL试管中，再分别依顺序加入0.25 mg/mL的总黄酮溶液0、0.5、1.0 、2.0 、4.0 、8.0 mL，在37 ℃恒温水浴反应20 min。取出质量分数为0.4%的对氨基苯磺酸溶液，加入2.0 mL，摇匀后静置5 min，然后再加入0.2%盐酸萘乙二胺溶液1.0 mL，静置5 min，最后用75 %乙醇加至15 mL，摇匀后再静置15 min。用75%乙醇做参比，在确定的最大吸收波长538 nm处测定其吸光度A0、AQ[14]，分别进行3次平行试验。计算公式如下：

式中：A0为未加供试品的吸光度；AQ为加入供试品的吸光度。

1.2.4不同紫花地丁总黄酮溶液浓度对DPPH自由基清除率的影响

DPPH溶液的制备：精密称取9.7 mg DPPH，加入少量无水乙醇，再用95%乙醇定容至250 mL，配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液(用棕色瓶装且暗处保存)。清除率的测定：取6支10 mL具塞比色管编号为1、2、3、4、5、6，将0.25 mg/mL总黄酮标准溶液稀释成0.016、0.031、0.063 、0.125、0.25 mg/mL。6支比色管同时加入1 mL DPPH溶液；再向1号比色管加入95%乙醇1 mL，其余5支比色管分别加入1 mL不同浓度的总黄酮溶液，最后用95%乙醇补足至4 mL。避光放置30 min后，以75%乙醇为参比，在确定的最大吸收波长517 nm处测定吸光度，分别进行3次平行试验。1号作为对照，测得吸光度A0,其余测得吸光度A1[14]。计算公式如下：

式中：A0为未加供试品的吸光度；A1为加入供试品的吸光度。

1.2.5不同紫花地丁总黄酮溶液浓度对OH自由基清除率的影响

第一组取6支洁净的10 mL具塞比色管，编号为1、2、3、4、5、6，每支比色管中依照顺序加入9 mmol/L硫酸亚铁溶液1 mL、8.8 mmol/L过氧化氢溶液1 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL，摇匀，在37 ℃恒温水浴加热20 min。取出，依次加入0.25 mg/mL总黄酮溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，再用75%乙醇补足至1 mL，摇匀之后继续在37 ℃水浴恒温加热20 min。之后在确定的最大吸收波长510 nm处测定吸光度A0，AS，平行3次实验。

第二组是为了消除色素的影响，另取5支10 mL比色管，分别编号②、③、④、⑤、⑥，分别依次加入9 mmol/L硫酸亚铁溶液1 mL、蒸馏水1 mL、9 mmol/l水杨酸-乙醇溶液1 mL，摇匀，在37 ℃恒温水浴加热20 min。取出，依次加入0.2 mg/mL总黄酮溶液0.2 、0.4、0.6 、0.8 、1.0 mL，再用75%乙醇补足至1 mL，摇匀之后继续在37 ℃水浴恒温加热20 min。之后在确定的最大吸收波长510 nm处测定吸光度AS0，平行3次实验[15]。

1.2.5.2 计算公式

式中：A0为空白对照液吸光度，其中只加入硫酸亚铁溶液、过氧化氢、水杨酸-乙醇溶液的吸光度；AS为加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、过氧化氢、不同浓度总黄酮溶液的吸光度；AS0为加入硫酸亚铁、水杨酸-乙醇、蒸馏水溶液、不同浓度总黄酮溶液的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 芦丁标准曲线

以芦丁浓度(mg/mL)为横坐标、吸光度值A为纵坐标绘制芦丁标准曲线，具体见图1。

图1 芦丁标准曲线

由图1可知，标准曲线Y=0.747 1x-0.008，R2=0.996 8。将纯化后总黄酮溶液的吸光度带入芦丁标准曲线，计算得到其浓度为0.25 mg/mL；计算得到的总黄酮纯品的纯度为50%。

2.2 不同紫花地丁总黄酮溶液浓度对亚硝酸盐清除率的影响

不同紫花地丁总黄酮溶液浓度对亚硝酸盐清除率的影响见图2。由图2可知，随着总黄酮加入体积增多，总黄酮对亚硝酸盐清除率也逐步增高，并且较低浓度的总黄酮溶液即可有清除亚硝酸盐的能力。仅仅在加入总黄酮浓度为0.2 mg/mL时，对亚硝酸盐的清除率就达到了63.01%，因而在此总黄酮浓度条件下，对亚硝酸盐清除效果较好。

图2 紫花地丁总黄酮对亚硝酸盐的清除率

2.3 不同紫花地丁总黄酮溶液浓度对DPPH自由基清除率的影响

不同紫花地丁总黄酮溶液浓度对DPPH自由基清除率的影响见图3。由图3可知，随着总黄酮溶液浓度的升高，总黄酮对DPPH自由基的清除率有升高，但从0.125 mg/mL开始清除率上升的趋势减弱，这说明清除率已经较高。尤其在紫花地丁总黄酮浓度达到0.016 mg/mL时，对DPPH自由基的清除率达到59.28%，而在0.25 mg/mL时，清除率达到83.23%。因此在0.25 mg/mL总黄酮浓度条件下，对DPPH自由基清除效果较好。

图3 紫花地丁总黄酮对DPPH自由基的清除率

2.4 不同紫花地丁总黄酮溶液浓度对OH自由基清除率的影响

不同紫花地丁总黄酮溶液浓度对OH自由基清除率的影响见图4。由图4可知，随着加入总黄酮溶液体积的增加，清除率逐步上升。并且在加入总黄酮溶液的浓度为0.25 mg/mL时，清除率达到69.65%。故可以确定，在此总黄酮浓度条件下，对羟基自由基清除效果较好。

图4 紫花地丁总黄酮对羟基自由基的清除率

3 结论

本实验经提取纯化得到的总黄酮提取物的含量为50 %。而后通过进一步的实验探究得到，当紫花地丁总黄酮浓度为0.2 mg/mL时，对亚硝酸钠清除率为63.01 %；浓度为0.25 mg/mL时，对DPPH清除率为83.23 %；浓度为0.25 mg/mL时，对·OH自由基清除率为69.65%，体现紫花地丁总黄酮溶液对亚硝酸钠、打破平衡和·OH自由基具有极好的抗氧化能力。并且经对比得出，在相同浓度的条件下，紫花地丁总黄酮溶液对DPPH自由基的清除率高于对·OH自由基的清除率和亚硝酸钠；清除率大小顺序为：DPPH>羟基自由基>亚硝酸钠。