褐化抑制对‘凤丹’试管苗扩繁培养中酚类物质含量及相关酶活性的影响

王若馨，王华芳

(1. 北京林业大学 林木育种国家工程实验室，北京 100083；2. 北京林业大学 生物科学与技术学院，北京 100083)

‘凤丹’(PaeoniaostiiT. Hong et J. X. Zhang var.‘lishizhenii’ B. A. Shen)属芍药科芍药属牡丹组(Paeoniasect. Moutan)杨山牡丹变种[1]，抗逆性强，适应性广，全国广为栽培，为中药牡丹皮(丹皮)主要品种，亦作观赏品种繁殖砧木。花单瓣，结实量大，籽油产量高，集观赏、药用与油用价值于一体。21世纪初将‘凤丹’拓展为新兴木本油料作物，其籽油不饱和脂肪酸含量92%以上，其中α-亚麻酸含量达44%，具有调节血压、血糖、血脂，增强免疫力，抗氧化等功效[2-4]。对‘凤丹’药食同源优良品种的繁育研究具有重要科学和生产实际意义。

‘凤丹’传统繁殖方式包括播种、嫁接、分株等，实生苗个体差异大，播种难以保持母株优良性状，嫁接和分株受材料、季节等诸多限制，繁殖系数低，难以实现工厂化标准化生产[5]。植物组织培养能实现快速繁育并保持母株优良性状。牡丹组织培养于1965年首次报道用胚为外植体诱导愈伤组织[6]，此后以花药[7]、腋芽[8]、茎尖[9]、叶片和叶柄[10]、子叶[11]等为外植体建立组织培养体系。‘凤丹’较一些草本植物含有较多酚类化合物，酚类物质分布在液泡中，当组织剪切或受伤时，酚类与质体或细胞膜上的多酚氧化酶(PPO)的区域化被打破，酶促反应使酚类被氧化，产生褐色有害的醌类物质，导致组织死亡[12]。据报道，‘凤丹’鳞芽在培养基上的第10天褐化率可达64.3%[13]。褐化成为‘凤丹’快速繁殖的主要瓶颈，严重影响产业化应用。近年来，用抗氧化剂抑制‘凤丹’培养物褐化也有报道，‘凤丹’扩繁培养基中添加维生素C(Vc)15 mg/L、核黄素(VB2)20 mg/L时，褐化级别由3级降为1级[5]。低温结合3 mg/L硝酸银(AgNO3)处理可使‘凤丹’鳞芽褐化率降至29.15%[14]。

褐化抑制机理的研究可为降低‘凤丹’试管苗褐化率及提高繁殖效率提供理论依据和技术支撑，而这方面的研究鲜有报道。总酚含量、多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)等与酶促褐化密切相关[12]。本研究以‘凤丹’不定芽为材料，选择不同浓度的维生素C、硝酸银以及不同时间的 4 ℃低温、暗处理，研究多种处理的抗褐化与扩繁效果；测定总酚含量、多酚氧化酶(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)活性，探讨‘凤丹’褐化发生的生理生化机理，为促进其组织培养产业化发展提供技术及理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料‘凤丹’(PaeoniaostiiT.Hong et J. X. Zhang var. ‘lishizhenii’ B. A. Shen)为笔者实验室继代保存，取自北京顺义基地(40.2°N，116.5°E)，年平均降水量610 mm，年平均气温11.5 ℃，最高温度42.0 ℃，最低温度-19.1 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 不同抗褐化处理对‘凤丹’试管苗褐化及生长的影响 选择生长健壮、表型一致的不定芽接种到改良WPM培养基[15]+6-BA 0.6 mg/L+IAA 0.1 mg/L+GA30.05 mg/L, 培养基分别添加抗褐化剂维生素C(50、75、100和125 mg/L)、AgNO3(20、40、60、80 mg/L)、黑暗预处理(1、3、5、7 d)、4 ℃低温预处理(1、3、5 d)，以不处理为对照进行培养，培养条件为(24±1) ℃，日光灯光密度为36 μmol/(m2·s)，光照16 h /黑暗8 h。每个处理6瓶，每瓶5个芽，重复3次。在转接后10、20、30 d取材分别统计相关数据。

转接后30 d统计褐化率(%)、褐化半径(褐色物质的溢出半径)、生长量(g)、增殖系数和死亡率(%)。增值芽的标准是有独立茎段且茎段长≥0.5 cm，茎基部直径≥0.4 cm，且能够单独切割下来进行培养的芽。褐化率=褐化数/接种数×100%；增殖系数=30 d的不定芽总数/接种的芽总数；在超净工作台上，将试管苗置于分析天平上称量，计算试管苗的生长量，生长量=W1-W0(W1为30 d后的质量，W0为转接时质量)；死亡率=死亡不定芽数/不定芽总数×100%。

1.2.2 生化指标测定 总酚含量测定参照毛沛琪等[16]方法略作修改。酶液制备参照毛沛琪等[16]方法；超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用氮蓝四唑NBT光化还原法[17]；过氧化物酶(POD)酶活性测定采用愈创木酚法[17]；多酚氧化酶(PPO)酶活性的测定采用邻苯二酚比色法[18]。每个处理3个生物学重复，3个技术重复。

1.3 数据处理

以Excel 2016计算数据标准误，IBM Statistical Package for Social Sciences 23.0软件对实验数据进行方差分析并进行Duncan’s多重检验及皮尔逊相关性分析。

2 结果与分析

2.1 抗褐化处理对‘凤丹’试管苗褐化率及褐化半径的影响

不同抗褐化处理对‘凤丹’试管苗的褐化率、褐化半径的影响如表1所示。AgNO3不同浓度处理的褐化率差异较大，褐化率随处理浓度的增大呈先降低后升高的趋势。其中， AgNO360 mg/L的处理褐化率最低，为23.33%，试管苗褐化程度浅，与对照组差异显著(P<0.05)，其他浓度处理的褐化率与对照组差异不显著。AgNO3处理的褐化半径与对照组差异不显著。随着Vc浓度的升高，褐化率呈现先降低后升高的趋势。培养基中分别添加Vc 75 mg/L和100 mg/L的试管苗褐化率显著低于对照组，分别为29.44%和31.59%，褐化程度较浅，渗出的褐色物质较少，Vc 75 mg/L与100 mg/L处理之间无显著差异，褐化半径与对照组差异也不显著。暗处理3 d与4 ℃低温3 ～5 d均能显著降低褐化率，褐化物质渗出物减少，褐化半径与对照差异不显著。以上表明在不同抗褐化处理控制‘凤丹’试管苗褐化方面，AgNO360 mg/L处理效果最好，褐化率降至23.33%。

2.2 抗褐化处理对‘凤丹’试管苗增殖系数、生长量及死亡率的影响

抗褐化处理对‘凤丹’试管苗的增殖系数、生长量及死亡率有影响(表1)。对照组试管苗的增殖系数为1.76，生长量为0.23 g，死亡率为 2.22%。培养基中添加Vc 50～125 mg/L，增殖系数与对照无显著差异(P>0.05)。添加Vc 100～125 mg/L则试管苗生长量显著降低，最低为0.16 g，且死亡率显著升高，同时植株出现玻璃化。添加AgNO360 mg/L能显著提高试管苗增殖系数至2.28，生长量达0.33 g；添加AgNO340～60 mg/L均能显著提高试管苗生长量，同时植株生长迅速，且无植株死亡。 暗处理1～7 d均能促进试管苗生长，植株生长较好，无死亡情况。其中，暗处理3 d的效果最好，增殖系数和生长量均显著高于对照组，无死亡现象。4 ℃低温处理的试管苗增殖系数随着处理天数的增加逐渐减小，死亡率逐渐上升，处理5 d死亡率达12.78%。以上不同处理效果最好的是暗处理3 d，增殖系数为2.30，生长量可达0.39 g。

表1 第30天时不同抗褐化处理的‘凤丹’试管苗褐化及生长情况Table 1 Browning and growth of P.ostii var. ‘lishizhenii’ tube seedlings under different anti-browning treatments on 30th day

2.3 抗褐化处理对‘凤丹’试管苗生理生化的 影响

2.3.1 总酚含量 以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制的标准曲线方程为y= 0.115 4x，相关系数R2=0.990 4，表明标准品梯度浓度线性关系良好，x的单位是μg/mL。不同抗褐化处理总酚含量变化如图2-A所示。在处理10 d时，对照及不同抗褐化处理的总酚含量与0 d时相比均有显著上升，分别增加54.64%、 43.83%、29.13%、46.32%、36.80%。随后，总酚含量呈现先升高后降低的趋势。各处理在30 d的总酚含量分别低于对照组13.68%、20.82%、 9.94%、18.09%，表明各处理均能降低酚类物质的含量。处理培养30 d时，除暗处理3 d组外的其他处理总酚含量均显著低于对照组(P< 0.05)，其中添加AgNO360 mg/L处理的总酚含量最低，仅为287.27 mg/kg。

2.3.2 多酚氧化酶活性 不同抗褐化处理的PPO活性随培养时间延长呈先升高后降低的趋势(图2-B)。对照及不同抗褐化处理的总酚含量与0 d时相比均有显著上升，增幅依次为对照 15.57%、暗处理3 d 12.69%、Vc 75 mg/L 8.87%、4 ℃低温3 d 5.07%、AgNO360 mg/L 3.61%，可以得出各抗褐化处理组均能一定程度降低PPO活性。培养10～30 d，各处理的PPO活性逐渐降低。各处理在30 d的总酚含量分别低于对照组6.52%、9.68%、4.93%、6.94%， 但差异不显著(P>0.05)。其中，添加AgNO360 mg/L处理的PPO最低，仅为74.35 U/(g·min)。

2.3.3 超氧化物歧化酶活性 抗褐化处理的SOD活性随培养时间的延长呈先升高后降低的趋势(图2-C)。培养10 d时，除对照组和 4 ℃低温3 d外其余组与0 d相比均显著上升，分别为31.15%、38.08%、28.28%。除4 ℃低温3 d外，各处理30 d的SOD活性均高于对照组，各抗褐化处理的SOD活性依次为AgNO360 mg/L>Vc 75 mg/L>暗处理3 d>对照>4 ℃低温3 d，但差异不显著(P>0.05)。其中添加AgNO360 mg/L的SOD活性最高，高于对照15.77%。

2.3.4 过氧化物酶酶活性 不同抗褐化处理的POD活性(图2-D)随培养时间的延长呈先升高后降低的趋势。各处理10～30 d，POD活性均高于对照组，且与0 d的POD活性差异显著(P<0.05)；处理10 d时，分别上升46.26%、87.04%、113.94%、81.52%，60.97%，表明各抗褐化处理均能提高POD活性。培养30 d时，AgNO360 mg/L和 3 d 4 ℃低温处理的POD活性显著高于对照组，其中添加AgNO360 mg/L，酶活最高可达53.32 U/(g·min)。

2.3.5 总酚含量、POD、PPO及SOD活性与褐化率的相关性分析 总酚含量、SOD、PPO及POD活性与褐化率的相关关系如表2，总酚含量与褐化率呈极显著正相关性，相关系数为0.758；过氧化物酶(POD)活性与褐化率呈显著负相关，相关系数为-0.610；多酚氧化酶(PPO)活性与褐化率呈显著正相关，相关系数为0.527；超氧化物歧化酶(SOD)活性与褐化率无明显相关性；总酚含量与POD呈极显著负相关，相关系数为-0.740。

表2 总酚含量、POD、PPO及SOD活性与褐化率的相关性分析Table 2 Correlations between browning degree,total phenolic content and activities of POD, PPO and SOD

3 讨 论

抗氧化剂和吸附剂等常用于牡丹组织培养的褐化抑制，‘乌龙捧盛’(Paeoniasuffruticosacv. ‘Wulongpengsheng’)培养基中加入2 mg/L的AgNO3能有效控制褐化，并促进组培苗生长与增殖[19]。‘洛阳红’(Paeoniasuffruticosacv. ‘Luoyang Red’)培养基中附加0.5 g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可减轻试管苗褐化[20]。本研究发现，适当浓度的Vc、AgNO3及黑暗、4 ℃低温处理能够有效防止‘凤丹’试管苗褐化，促进生长。添加60 mg/L AgNO3抑制褐化效果最佳(表1)，褐化率降至23.33%，植物受伤产生大量乙烯致使试管苗褐化，银离子可破坏乙烯受体，抑制培养物褐化的发生。但是随着银离子浓度的升高，褐化也加重，这可能是高浓度的银离子使培养物中毒所致[21-22]。暗处理3 d促进生长(表1)，增殖系数增至2.30，生长量较对照组增长0.15 g。该结果与程强强等[23]对蝴蝶兰(Phalaenopsis)不定芽扩繁的研究结果一致。暗处理使细胞内GA含量升高，GA可促进细胞延长[24]。因此，较短时间的暗培养有助于‘凤丹’芽的增殖和生长。

‘凤丹’试管苗褐化率与总酚含量呈极显著正相关。因此降低总酚含量可以有效地减轻褐化。由于不同物种或同一物种的不同部位酚类物质种类和含量不同[13,25]，幼嫩的、活力旺盛的组织中酚类化合物积累较少，其褐化也较轻微。在实际操作中，选择幼嫩的、生命活力旺盛的材料，如胚、分生组织等，便于建立抗褐化培养体系。‘凤丹’中酚类物质种类及含量对组织褐化抑制也至关重要，相关研究有待进行。总酚含量与POD活性呈极显著负相关，Francisco等[26]发现POD利用培养物受伤后释放的H2O2来催化酚类物质氧化。因而可通过提高POD活性使更多酚类物质发生转化，具体结果还有待进一步研究。

褐化率与总酚含量和PPO、POD及SOD酶活变化的关系在多个物种中都有报道。许传俊等[27]发现蝴蝶兰(Phalaenopsis)外植体褐变与PPO、POD的活性呈正相关。Boonsiri等[28]对低温贮藏的尖辣椒(CapsicumannuumL.)种子褐变研究发现褐变与POD呈负相关。本研究结果表明褐化率与PPO酶活呈显著正相关，而与POD酶活呈显著负相关，而SOD与褐化率并无显著的相关性，这一结果与其他物种中褐化与酶活关系的研究结果有相似但也有所不同[27-30]。PPO在植物体中催化酚类物质形成醌类物质，醌类物质经非酶促聚合生成有害褐色物质，致使培养物死亡[31]。POD可催化清除组织中的H2O2和超氧阴离子，保护细胞膜透性，抑制褐变发生[32]。这表明PPO和POD与降低‘凤丹’试管苗褐化关系密切。反义PPO基因可抑制多酚氧化酶活性，降低酚类物质含量以减轻马铃薯(SolanumtuberosumL.)块茎损伤褐化[33]。在后续研究中，可通过寻找并调节与酚类含量相关的酶及其基因的表达，从而达到抑制‘凤丹’植物组织培养褐化的目的，有关研究将根据需要不断深入，为其优质苗木规模化生产提供理论和技术支撑。

4 结 论

本研究以‘凤丹’试管苗为研究对象，发现培养基中添加硝酸银60 mg/L褐化抑制效果最好，3 d暗处理增殖效果最好；试管苗总酚含量、多酚氧化酶(PPO)与褐化率呈现极显著正相关(P<0.01)，过氧化物酶(POD)显著负相关(P< 0.05)，超氧化物歧化酶(SOD)无显著相关性，总酚含量与POD呈极显著负相关(P<0.01)，表明PPO和POD与 ‘凤丹’试管苗褐化关系密切，其调控及基因的表达有极大的研究价值。