貉细小病毒分离鉴定及其VP2 基因序列分析

（胶州市动物疫病预防与控制中心，山东胶州 266300）

貉 细 小 病 毒（raccoon dog parvovirus，RDPV）属细小病毒科细小病毒属，为无囊膜单链DNA 病毒[1]。其核衣壳由VP1、VP2 和VP3 蛋白组成[2]。一般认为，RDPV 最早由犬细小病毒（CPV）跨宿主感染貉而产生，是CPV 的同属异种病毒[3]。1984 年，我国黑龙江省首次报道发生貉细小病毒性肠炎。1988 年，夏咸柱等[4]从我国不同地区肠炎病貉中分离出3 株RDPV，从而证实我国存在RDPV。2008—2018 年，我国黑龙江、辽宁、山东等省份相继有分离到RDPV 的报道[5-9]。

RDPV 引起的貉细小病毒性肠炎发病率和死亡率较高，严重危害貉养殖业。在幼貉群中，RDPV常呈地方性流行，主要引起发病貉腹泻，导致胃肠炎性变化，剖检可见肠道出血、胃肠黏膜脱落。本研究从山东省某貉养殖场分离到1 株RDPV。为了解RDPV 特性及其致病特点，对其VP2基因进行了序列分析、理化特性研究，以及貉人工感染试验，以期为RDPV 研究及流行病学调查提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 病料处理

将采自山东省某貉养殖场腹泻貉粪便，按照1:5的体积比加入适量生理盐水，研磨后10 000 r/min 离心15 min；取上清加入等体积氯仿，室温作用30 min后，12 000 r/min 离心15 min；弃去氯仿，将病毒液经0.22 μm 过滤除菌，-15 ℃以下保存备用。

1.2 病毒分离

按照同步接毒方法，将过滤的病毒液接种到F81 细胞，接种比例为5%；接种后次日换维持液，每日观察细胞病变情况，若无细胞病变（CPE）则将细胞培养物冻融后按相同方法继续传代，待CPE 达80%以上时收获病毒液。

1.3 病毒组织细胞半数感染量（TCID50）测定

取CPE 病变稳定的第2 代病毒液依次进行10-3～10-8稀释，分别接种于F81 细胞96 孔细胞培养板中，每个稀释度做8 个重复，0.1 mL/孔，每孔补加0.1 mL 的培养液；同时设正常细胞为对照组，观察120 h，记录病变孔数目，按Reed-Muench 法计算病毒的TCID50。

1.4 猪红细胞凝集试验

猪前腔静脉采血，制备1%猪红细胞悬液，在血凝板中每孔加入25 μL PBS（pH6.4），从第1 孔加入25 μL 样品开始，依次倍比稀释，至第15、16 孔只加25 μL PBS，以此作为红细胞对照孔，每孔另加25 μL PBS，再加入1%猪红细胞悬液25 μL，混匀后4 ℃冰箱作用50 min；取出判定结果。以100%红细胞凝集的最高稀释度作为血凝判定终点。

1.5 VP2 基因PCR 扩增与序列测定

将提取的病毒基因组为模板，按照常规方法进行PCR 反应。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，32 个循环；72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR 产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。将PCR 产物送上海生工测序公司进行克隆测序。扩增序列大小为1 755 bp，同时用ddH2O 作为阴性对照。VP2测序引物序列如下：P1：5'-ATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGACGGTGGTCAAC-3'；P2：5'-TTAATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTGAGATTTTTCA-3'

1.6 理化特性的鉴定

按文献[10]的方法测定分离毒株对氯仿、pH3.0 和55 ℃的耐受性。在病毒液中加入氯仿，使其终体积比为4.8%，震荡20 min，3 000 r/min离心30 min，然后吸取病毒液，过滤除菌，作为氯仿处理组；将病毒液置于2 mL EP 管中，于55 ℃水浴20 min，作为热处理组；用0.1 mol/L 的盐酸溶液调病毒液的pH 为3.0，置于4 ℃感作12 h，用0.1 mol/L 的NaHCO3调pH 至7.0 左右，作为酸处理组。将3 组分别测定病毒含量。

1.7 动物回归试验

挑选CPV HI 抗体阴性的貉3 只，经过食道灌服20 mL 分离毒株病毒液（含20×106.5TCID50），攻毒后连续观察10 d，记录貉的发病情况。

2 试验结果

2.1 病毒分离

将病料处理后的上清，同步接种于F81 细胞，盲传至第2 代，接种后48 h，发现F81 细胞出现拉网等细胞病变（图1-A），正常细胞组无病变（图1-B）。

2.2 病毒组织细胞TCID50 测定

按Reed-Muench 法计算的病毒TCID50=10-6.5/mL。

2.3 猪红细胞凝集试验

图1 F81 细胞病变情况（40×）

取第2～8 代病毒液进行HA 效价测定，发现病毒对猪红细胞的凝集能力基本稳定，HA 效价稳定在213。

2.4 VP2 基因PCR 扩增与序列测定

取病毒液进行PCR 鉴定，同时用ddH2O 作为阴性对照，结果扩增出约1 700 bp 的目的条带（图2）。将PCR 产物送上海生工测序公司进行克隆测序，将测序结果与GenBank 中的RDPV、CPV 及MEV 进行比对，结果发现分离毒株与RDPV 核苷酸的同源性为99.4%（图3）。系统进化树分析发现，分离毒株与RDPV 和CPV-2 为同一分支（图4）。因此，将分离株命名为RDPV SD001 株。

2.5 理化特性鉴定

分离毒株对氯仿、pH3.0 和55 ℃的耐受性试验结果显示，经过以上处理后的病毒含量测定结果变化不大，表明分离毒株对氯仿不敏感，且对酸、热均耐受。

图2 分离毒株的PCR 鉴定结果

图3 分离毒株VP2 基因核苷酸同源性分析结果

图4 分离病毒VP2 基因遗传进化分析结果

2.6 动物回归试验

将分离毒株第5 代病毒液，经过食道灌服20 mL（含20×106.5TCID50）攻毒3 只健康貉，发现攻毒后第4 日，貉出现精神不振、腹泻、呕吐等症状。采集攻毒后5 d 的粪便，用1%猪红细胞测定HA效价，结果3 只貉的粪便HA 效价均不低于210；攻毒后6 d，死亡2 只；攻毒后7 d，全部死亡。死亡貉眼窝凹陷（图5-A），剖检可见肠黏膜出血（图5-B），肠系膜淋巴结水肿，胃内空虚，有煤焦油样黏液（图5-C），胃黏膜出血（图5-D），符合典型的貉细小病毒病症状。

图5 攻毒后貉发病症状

3 讨论

本研究对分离毒株VP2基因进行序列分析，并与RDPV 参考毒株、CPV 毒株、MEV 毒株进行同源性比较和遗传进化分析，发现分离毒株属于CPV-2 型。有学者[8]推断，这可能是因为多数养殖场长期应用CPV-2 弱毒疫苗，导致免疫犬排毒直接感染了与其接触的未免疫貉。貉本身是CPV-2的易感动物，CPV-2 弱毒株可以在易感动物间传播复制的过程中毒力返强，成为使貉发病的强毒株[11]。

目前除山东省有貉细小病毒病发生外，河北省、黑龙江省也均有报道。可见貉细小病毒病已成为威胁貉养殖业的重要疫病。现在市场上的疫苗主要有针对水貂的病毒性肠炎灭活疫苗，水貂犬瘟热、肠炎二联活疫苗以及针对犬的细小病毒类疫苗。目前貉养殖户仍采用上述疫苗进行免疫，但是由于病毒之间存在差异，貉细小病毒病并没有得到有效控制，因此研发针对貉细小病毒病的疫苗很有必要。