口蹄疫病毒A 型竞争ELISA 抗体检测试剂盒在流行病学调查中的应用

陈小丽，邵 钰，仲焕香，宫枫举，汤荣福，孙学强，3，张 志，3

（1.三明市农业农村局，福建三明 365000；2.青岛立见诊断技术发展中心，山东青岛 266114；3.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032）

口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）属于微核糖病毒科（Picornaviridae），自发现至今已经有近百年的流行史[1]。FMDV 分为O、A、Asia I、SAT1、SAT2、SAT3 和C 型等7 个血清型。我国曾流行O、A、Asia I 等3 种血清型，现主要以O 型和A 型为主[2]。A 型FMDV 抗原十分复杂。根据病毒粒子衣壳主要结构蛋白VP1 对应的核苷酸序列，可以将A 型FMDV 分为AFRICA、ASIA 和EURO-SA 等3 个拓扑型[3-4]。而引起湖北武汉2009 年牛A 型FMD 疫情和广东茂名2013 年猪A 型FMD 疫情的病原均属于A 型ASIA 拓扑型FMDV，这也是我国目前的A 型主要流行类型[5]。

疫苗免疫是有效防控FMD 的方法。我国目前使用的A 型FMDV 疫苗株包括AF/72 和Re-A/WH/09 株等[6]。由于A 型FMDV 抗原谱具有多样性，因此常采用抗体检测的方法来评价FMD 疫苗的免疫效果。国家标准《口蹄疫诊断技术》（GB/T 18935—2018）也规定了多种FMDV 抗体检测方法，其中液相阻断ELISA（LPB-ELISA）使用时间长，也是国际公认的FMDV 抗体检测方法。但LPBELISA 操作步骤繁琐，反应时间较长；而固相竞争ELISA（cELISA）方法操作简便、时间短、特异性高，越来越受到人们的青睐。为评估cELISA 试剂盒的性能，对2017 年从福建省三明市采集的336 份牛、猪、羊临床血清样品，采用青岛立见诊断技术发展中心研制和生产的FMDV A 型cELISA 抗体检测试剂盒进行抗体检测，同时与LPB-ELISA 试剂盒进行比对，以期为我国开展A 型FMD 的血清流行病学监测提供候选检测方法。

1 材料与方法

1.1 血清

羊血清、猪血清、黄牛血清各92 份，奶牛血清60 份，均于2017 年采集于福建省三明市，其中羊血清和猪血清采自屠宰场/点，黄牛血清采自散养户，奶牛血清采自规模养殖场。

1.2 试剂盒与主要仪器

FMDV A 型cELISA 抗体检测试剂盒，为青岛立见诊断技术发展中心生产，批号为020 252003；FMDV A 型LPB-ELISA 抗体检测试剂盒，购自中国农业科学研究院兰州兽医研究所，批号为2020072801。酶标仪，购自Tecan 公司。

1.3 方法

1.3.1 临床血清检测 采用FMDV A 型cELISA抗体检测试剂盒，对336 份临床血清进行检测，操作方法按照说明书操作。

1.3.2 LPB-ELISA 试剂盒验证 从4 种血清中各挑选10 份血清（阴性、阳性各5 份）共40 份，采用LPB-ELISA 抗体检测试剂盒进行验证，操作方法参照产品说明书。

1.3.3 结果判定 cELISA 检测试剂盒试验成立的前提是：阴性对照平均OD 值（ODNC）应大于0.5，且阳性对照平均OD 值（ODPC）的抑制率大于50%，试验结果有效，否则重新进行试验。血清样品抑制率（ODS）=（ODNC-ODS）/ODNC×100%；样品抑制率≥50%判为阳性，＜50%判为阴性。LPB-ELISA：抗体滴度≥1:128 为阳性，1:64～1:128为疑似，＜1:64 为阴性。

2 结果

2.1 临床血清检测

用A 型cELISA 抗体检测试剂盒，在336 份羊、猪、黄牛、奶牛血清样品中，均检测出阳性样品，阳性检出率分别为11.96%、20.65%、13.04%、86.67%（表1）。

表1 牛、羊、猪血清的cELISA 检测结果

2.2 临床血清检测结果分布规律

从cELISA 试剂盒的检测结果看，不同物种间的抗体效价存在较大差异。其中：奶牛阳性检出率最高，达86.67%，且阳性样品的抑制率集中于80.00%～95.00%；羊、猪和黄牛的阳性检出率介于11.96%～20.65%，且阳性样品的抑制率零星分布于50.00%～90.00%，没有明显的聚集性。详见图1。

图1 样品分布散点图

2.3 LPB-ELISA 验证

用LPB-ELISA 对40 份血清进行验证的结果（表2）显示：cELISA 检测为阳性的20 份血清中，用LPB-ELISA 检出阳性19 份；cELISA 检测为阴性的20 份血清中，用LPB-ELISA 检出阴性17 份。根据结果进行统计，两种方法的κ值为0.8，总符合率为90.00%（表3）。

3 分析和讨论

FMDV 主要感染猪、牛、羊、骆驼、鹿等偶蹄动物，给养殖业带来了重大的经济损失。FMDV宿主主要通过体液免疫应答产生抗体进行保护，也就是抗体水平特别是中和抗体水平的高低决定了机体的保护力[7-8]。疫苗免疫是该病最有效的预防手段，但需要通过抗体效价检测评价疫苗免疫效果。常见的FMDV 抗体检测方法有病毒中和试验、cELISA 方法和LPB-ELISA 方法。这些方法也是国际贸易中OIE 指定的检测方法[9]。病毒中和试验由于需要细胞培养和使用活病毒，且需2～3 d 才能出检测结果，因而在日常监测中很少使用。LPBELISA 敏感性较高，在我国应用最为广泛，但因其采用全病毒作为检测抗原，不同血清型抗体间存在交叉反应，所以容易出现假阳性，且操作步骤繁琐，反应时间较长。cELISA 是利用FDMV 诱导免疫应答的主要基因VP1作为包被抗原，抗A 型FMDV单克隆抗体作为酶标记抗体制备而成的，具有较高的特异性和敏感性，不存在排毒的生物风险，且操作简便、用时短，全部试验耗时不超过1 h，因此逐渐替代LPB-ELISA 用于评价疫苗免疫效果[10]。

表2 LPB-ELISA 试剂盒的验证结果

表3 cELISA 和LPB-ELISA 试剂盒的验证结果 单位：份

为了验证青岛立见诊断技术发展中心生产的A 型FMDV cELISA 抗体检测试剂盒的临床应用效果，本研究对2017 年临床采集的羊、猪、黄牛和奶牛等家畜血清进行了A 型FMDV 抗体检测，结果发现奶牛的抗体阳性率（86.67%）明显高于其他畜种（11.96%～20.65%）。这可能与国家口蹄疫免疫计划调整有关。2016 年，农业部不再要求进行A 型FMD 全免，而是对重点地区和畜种采取免疫措施。福建省执行的政策是对所有奶牛和种公牛进行A 型FMD 免疫。从检测结果看，奶牛A 型FMDV 抗体效价较高，感染风险较小；而不免疫的羊、黄牛和猪效价较低，存在一定的感染风险。

从LPB-ELISA 和cELISA 两种试剂盒对40 份血清样品的检测比对结果来看，cELISA 检测为阳性的20 份血清，用LPB ELISA 检测出19 份阳性，表明二者的敏感性基本一致；cELISA 检测为阴性的20 份血清，用LPB-ELISA 检测出17 份阴性，即有3 份cELISA 阴性血清用LPB-ELISA 检测为阳性。据推测，LPB-ELSIA 使用全病毒包被酶标板后，容易与O 型等其他血清型产生的抗体之间发生交叉反应而产生较多的假阳性。另外，两种方法的κ值为0.8，表明二者的一致性较好，总符合率为90.00%，进一步表明cELISA 可以替代LPBELISA 试剂盒用于临床流行病学调查。