广西玉林市规模化禽场禽流感病毒检测

刘香林，甘一波，李 汝，李 苗，梁俊武，丁 伟，钟晓宁，宋诗川，周 锐，黄 宇，段振华

（1.玉林市动物疫病预防控制中心，广西玉林 537000；2.福绵区动物疫病预防控制中心，广西玉林 537023；3.北流市动物疫病预防控制中心，广西北流 537400；4.博白县动物疫病预防控制中心，广西博白 537600）

禽流感（avian influenza，AI）是由A 型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的一种急性和高度接触性传染病，几乎所有的野生和家养禽类都可感染。基于病毒表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）蛋白抗原性不同，AIV 可分为16 个H 亚型（H1—H16）和9 个N 亚型（N1—N9）。另外，根据AIV 致病性和毒力不同，AI 又可分为高致病性禽流感（HPAI）、低致病性禽流感（LPAI）和无致病性禽流感。HPAI 主要是由H5和H7 亚型引起，不仅给国内外家禽养殖业造成巨大经济损失，而且也威胁到人类健康。LPAI 主要以H9 亚型为代表，一年四季均有发生，但多发于秋冬季节，尤其是秋冬、冬春交接等气候变化较大的时期。LPAI 的危害虽然比HPAI 小，但一旦感染，也可引起家禽生产性能下降、免疫抑制，甚至发病和死亡。近年来我国一直将HPAI 纳入国家强制免疫计划，并根据不同地区的病毒变异和流行情况，及时调整疫苗毒株。2019 年12 月26 日，农业农村部印发《2020 年国家动物疫病强制免疫计划》，要求各地要加快推进“先打后补”的强制免疫政策。玉林市是广西家禽养殖大市。为了解规模禽场的AIV 感染情况，对广西玉林市7 个县（市、区）28 个规模化鸡场和14 个规模化鸭场进行了H5、H7、H9 等亚型的AIV 检测，以便为指导广西玉林市AI 防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集和处理

在广西玉林市7 个县（市、区），按照配额抽样方式，每个县（市、区）随机选择年出栏量5万羽以上的4 个规模化鸡场和2 个规模化鸭场，共28 个鸡场、14 个鸭场作为研究群，按照玉林市2020 年家禽规模场AI 日常监测要求，每个场随机采集30 份喉/泄殖腔棉拭子。将采集的喉/泄殖腔棉拭子放入含1 mL 生理盐水的无菌EP 管中，编号后冷藏，2 h 内送至实验室。将样品漩涡混匀，10 000 r/min 离心5 min；取400 μL 上清液装入1.5 mL无菌EP 管中，进行RNA 抽提或保存于-70 ℃冰箱备用。

1.2 主要仪器与试剂

Centrifuge 5424 台式离心机，德国Eppendorf公司产品；TGuide S32 核酸自动抽提仪，北京天根公司产品；LC96 荧光定量PCR 仪，Roche 公司产品。AIV 通用型核酸检测（荧光PCR）试剂盒、H5/H7 亚型核酸检测试剂盒（双重荧光PCR 法）、H9 亚型核酸检测试剂盒（荧光PCR 法），均购自深圳市梓健生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA 抽提 将混匀离心后的棉拭子样品上清液，按TGuide S32 磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒说明书进行RNA 提取。

1.3.2 PCR 检测 首先按照AIV 通用型核酸检测（荧光PCR）试剂盒说明书要求，对样本抽提的RNA 进行AIV 检测。对检测为AIV 阳性样本，按照H5/H7 亚型核酸检测试剂盒（双重荧光PCR 法）、H9 亚型核酸检测试剂盒（荧光PCR 法）说明书要求进行H5、H7 和H9 分型鉴定。

2 结果

2.1 规模化鸡场

对28 个规模化鸡场的840 份鸡喉/泄殖腔棉拭子样品进行AIV 核酸检测。结果（表1）显示：在博白和福绵两地抽检的鸡场样品中，各有2 个鸡场检测到阳性样品；检出通用型阳性样本59 份，样品阳性率为7.02%，其中H9 亚型18 份，其他亚型41 份，全为LPAIV。

2.2 规模化鸭场

对广西玉林市14 个规模化鸭场的420 份鸭喉/泄殖腔棉拭子样品进行AIV 核酸检测，结果在博白、福绵和北流三地抽检的4 个鸭场样品中，检测到通用型阳性样品74 份，样品阳性率为17.62%；阳性样本全部为其他亚型的LPAIV，其中福绵区检出率最高，样品阳性率高达80.00%（表2）。

表1 广西玉林市各县（市、区）规模化鸡场AIV 检测结果统计

表2 玉林市各县（市、区）规模化鸭场AIV 检测结果统计

3 讨论

随着疫苗的普遍推广使用，HPAIV 引发的疫情在我国呈现缓发态势[1]。由于AIV 亚型众多，各亚型和毒株间无交叉免疫保护，疫苗免疫并不能阻止所有AIV 的侵入，因此我国各地经常有LPAIV 在野鸟、家禽和环境中被检出的报道。对LPAIV 调查研究[2-5]显示：野鸟作为AIV 的天然宿主、携带者及传播者，在与放养家禽密切接触下，可将野鸟源性的不同亚型毒株传递至放养禽并在其体内重排或交换，尤其是在水禽，各种亚型LPAIV 基因重组的概率很高，从而加速了病毒的种间传播；家禽中的AIV 可以通过基因重排，为感染人类的AIV 提供基因，或直接突破种间屏障感染人。因此，在家禽养殖中，做好AI 防控不但具有重要的经济价值，而且对人类公共卫生安全意义重大。

调查发现：广西玉林市未检出AIV 阳性的规模化鸡场，主要采用笼养模式；未检出AIV 阳性的鸭场，其周围适宜野鸟栖息的山林、树木较少，场地干湿分离，环境整洁卫生，水源充足。而4 个AIV 阳性鸡场、4 个AIV 阳性鸭场，其饲养方式均为林下或野外放养，环境卫生状况不佳，与野禽接触频率较高，其中2 个鸭场阳性样品检出率分别为38.33%和80.00%，平均死淘率高达13.50%，远高于其他禽场。这一结果与国内其他地区报道的水禽是AIV 储存库和传染源，一旦感染，AIV 更容易在群体中传播扩散的结论相一致[6-7]。

本次抽检未在玉林市规模化鸡场和鸭场检出H5 和H7 亚型HPAIV。这可能与H5 和H7 亚型HPAI 的持续强制免疫有关，表明禽场的全群免疫可有效防控H5、H7 亚型HPAIV 侵袭。部分规模禽场受养殖模式或购苗影响，其禽群中会有不同程度的多亚型LPAIV 混合感染。虽然H9 亚型和其他亚型暂时没有引起鸡场、鸭场饲养的家禽大规模死亡，但有可能会增加禽群的死淘率。由于本次检测试剂有限，仅对H5、H7、H9 亚型AIV 进行了分型鉴定，对其他亚型AIV 还有待进一步鉴定。

AIV 在不同区域间的主要传播途径有候鸟传播和人为传播。禽类是AIV 的天然宿主，比如家禽、宠物鸟类、观赏鸟类、捕获的野生鸟类等，其在人类的饲养和贸易活动过程中，极易造成AIV 传播；此外，候鸟迁徙被认为是另一重要AIV 传播途径[8-10]。因此，良好、科学的饲养方式是预防AI的关键，应特别注意避免在候鸟迁徙过境、栖息滞留水域饲养家禽，避免与野鸟接触的家禽养殖模式有利于降低AIV 的传播风险；规模化禽场要加强管理，严格执行疫苗免疫接种和环境消毒工作；规范活禽交易和运输，定期对活禽交易市场进行病毒监测和消毒。

自2020 年起，HPAI 的免疫政策将由政府采购疫苗，免费供养殖场免疫接种，逐步过渡到养殖场“先打后补”。在该政策的实施过程中，各级相关部门要加强该政策的宣贯，在疫苗采购、储存、免疫接种、免疫效果评估等方面做好技术指导，继续加强禽流感防控。

4 结论

在当前高致病性禽流感（H5+H7）三价灭活疫苗的强制免疫政策下，广西玉林市规模化禽场的HPAIV 感染风险较小，未检出HPAIV 病原，但仍有H9 等亚型LPAIV 的流行，存在LPAIV 重组变异为HPAIV 的风险，因此仍须继续加强AI 的免疫与监测，做好综合防控。