甲氟喹对胶质瘤细胞的放射增敏作用

缪雨季，周倬，常青

前言

放射治疗是常用的治疗人胶质瘤的手段，但由于胶质瘤细胞具有一定的辐射抗性，降低了放疗效果。放射增敏剂能够增强电离辐射杀伤肿瘤细胞的能力，有效应对肿瘤细胞的辐射抗性。但放射增敏剂存在一些缺点：放射增敏剂本身毒性大，不能顺利达到病灶等，这些缺点限制了放射增敏剂的应用。甲氟喹是治疗疟疾和预防疟疾的常见药物［1-2］，研究发现其可通过抑制蛋白质的合成进一步强化X 射线对肿瘤细胞的杀伤作用［3］。甲氟喹还可以通过线粒体途径促进肿瘤细胞凋亡，细胞凋亡是X射线杀灭肿瘤细胞的形式之一［4］。此外甲氟喹还具有电效应和模拟效应，能顺利到达病灶且毒性较低［5-6］。本文以上述几点为理论基础，通过体外细胞实验，探究甲氟喹对胶质瘤U251 细胞的放射增敏效果，以期为治疗脑胶质瘤提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞株与主要试剂

人脑胶质瘤U251细胞来自中国科学院上海分子生物学研究所。DMEM（美国GIBCO公司）完全培养液，10% 灭活胎牛血清（美国Hyclone 公司），置37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养。甲氟喹（mefloquine）购自上海百灵威化学技术有限公司，谷胱甘肽（Glutathione,GSH）购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒及DCFH-DA 活性氧试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 放射源及照射条件

所用照射源为直线加速器（Primus-M,西门子,德国），使用6 MV X射线进行照射，照射野为20 cm×20 cm，机架角为180°，细胞培养板底面放置1.5 cm厚硅胶组织作为补偿，源皮距为100 cm，剂量率为300 cGy/min，室温下照射。照射后的细胞置37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中继续培养至指定时间。

1.3 药物毒性实验

取对数生长期状态良好的细胞，胰酶消化后，制成单细胞悬液，加入100 μL至96孔板种，密度为1×104个细胞/孔，放入37 ℃培养箱中孵育24 h。弃掉孔内培养液，加入100 μL含有不同浓度甲氟喹的培养液至孔中，同时设置对照组、空白组，且每个组别设置5个复孔。继续孵育24 h，向每孔中加入CCK-8溶液。继续在37 ℃培养箱中孵育4 h，然后用酶标仪，选择波长为450 nm检测其Dλ值变化。根据5个复孔的平均值，计算得到细胞存活率。

1.4 辐射增敏实验及数据分析

取对数生长期状态良好的细胞，胰蛋白酶消化后，制成单细胞悬液，加入1 mL 细胞悬液至六孔板中，每孔约500个细胞。将六孔板置于培养箱中培养24 h 后，弃掉孔中的旧培养液，加入含有不同浓度的甲氟喹培养液1 mL，继续培养24 h。用X 射线照射细胞，X射线剂量为0、2、4、6、8 Gy。随后弃掉原培养液，用PBS 清洗细胞两遍，重新加入新鲜培养液。继续培养，每隔3 d 更换一次培养液，同时在显微镜下观察细胞克隆形成数目。至第8天时，细胞克隆数目明显，终止培养，用吉姆萨染液染色。在显微镜下计数，以50个细胞以上细胞团为一个克隆数，统计克隆数，计算克隆形成率。采用Origin8.0 软件，根据单靶多击模型拟合细胞存活曲线，求得放射生物学参数，计算放疗增敏比（Sensitive Enhancement Ratio,SER）。

1.5 细胞凋亡检测实验

选择对数生长期状态良好的细胞，制成单细胞悬液，均匀接种于六孔板中，放入培养箱中培养24 h。设置空白对照组、甲氟喹组、照射组、甲氟喹照射组。甲氟喹组、甲氟喹照射组加入含有甲氟喹的培养液。在37 ℃培养箱中孵育24 h 后，X 射线组的细胞受到6 Gy 照射，其余处理条件与空白对照组完全相同。随后弃掉原培养液，重新加入新鲜培养液置于37 ℃培养箱中继续培养，待72 h 后，取出六孔板，流式细胞术检测各组细胞凋亡情况。

1.6 细胞胞浆活性氧检测

细胞分组及处理与细胞凋亡检测实验相同。按照说明书检测各组细胞的活性氧水平。

1.7 统计学处理

数据采用SPSS21.0 软件进行分析，计量资料符合正太分布以均数±标准差表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK 法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 甲氟喹对胶质瘤细胞的增殖抑制作用

如图1所示，胶质瘤细胞的存活率随着甲氟喹浓度升高而逐渐下降，呈现明显的剂量效应关系。采用Origin8.0软件分析得到IC20值（细胞存活率为80%的甲氟喹浓度）为43 μmol/L。为了避免或尽量减少药物本身对细胞的毒性作用，放射增敏使用的甲氟喹浓度不应超过其IC20值［7］。故本文主要研究20、40 μmol/L浓度的甲氟喹对U251细胞的放射增敏作用。

图1 不同浓度甲氟喹作用下U251细胞的存活率Fig.1 Survival rate of U251 cells under different concentrations of mefloquine

2.2 甲氟喹对胶质瘤细胞的放射增敏作用

本研究以SER 作为评价辐射增敏剂增敏效果的主要指标，其计算方法为：SER=单纯照射组D0/加药照射组D0值。式中，D0为细胞的平均致死剂量，单位：Gy。克隆形成实验用于分别计算甲氟喹组和无甲氟喹组U251 细胞的平均致死剂量D0。如图2所示：随着照射剂量的增加，对照组和甲氟喹组细胞存活分数均显著降低。甲氟喹照射组的U251细胞存活分数低于相应的照射组细胞的存活分数（P＜0.05）。

图2 甲氟喹联合X射线作用后U251细胞的存活分数Fig.2 Survival fraction of U251 cells after being treated with mefloquine combined with X-ray

根据体外细胞剂量存活曲线的单击多靶模型，其公式为：S= 1-(1- e^(-D/D0))^n，式中，S 为存活分数，D为受照剂量（单位：Gy），D0为细胞的平均致死剂量（单位：Gy），n为靶点数目，e 为自然对数。将甲氟喹联合X射线作用U251细胞后的剂量信息和存活分数代入该公式中拟合得到相应的D0值、n值，结果见表1。

表1 甲氟喹联合X射线作用U251细胞集落存活曲线参数Tab.1 Colony survival curve parameters of U251 cells treated with mefloquine and X-ray

2.3 甲氟喹联合X 射线照射对胶质瘤U251 细胞凋亡的影响

细胞凋亡是常见的电离辐射诱导细胞死亡的形式。由表2可以看出，U251 细胞在X 射线照射后第3天，甲氟喹组与对照组相比，细胞凋亡率明显上升，说明甲氟喹能够增加X射线诱导的U251细胞凋亡。

2.4 甲氟喹联合X 射线引起胶质瘤U251 细胞活性氧水平变化

图3为X 射线照射后第3 天的DFCH-DA 平均荧光强度图。从图中数据可以看出，40 μmol/L 和20 μmol/L甲氟喹照射组与照射组相比，DCFH-DA平均荧光强度均大幅上升。以上结果证明甲氟喹可以提高X射线照射导致的U251细胞活性氧水平增加。

表2 甲氟喹联合6 Gy X射线作用后第3天U251细胞的凋亡率（n=3）Tab.2 Apoptotic rate of U251 cellsthe third day after being treated with mefloquine combined with 6 Gy X-ray(n=3)

2.5 甲氟喹联合X 射线诱导活性氧水平升高与细胞凋亡的关系

为了进一步研究活性氧水平升高与甲氟喹联合X 射线诱导的U251 细胞凋亡的关系，选用活性氧清除剂GSH 处理甲氟喹照射组的U251 细胞。结果如图4所示，对不同剂量水平甲氟喹处理的U251 细胞，其X 射线照射后GSH 处理组凋亡率均低于相应对照组。以上结果提示，GSH 清除U251 细胞内多余的活性氧后，甲氟喹联合X射线引起细胞凋亡增加的效应得到了显著抑制，说明活性氧水平升高可能是甲氟喹增加X射线作用后U251细胞凋亡率的机制之一。

3 讨论

甲氟喹是人工合成的4-喹啉-甲醇衍生物，具有抗疟疾［8］、抗血吸虫［9-10］、抑制肿瘤细胞增殖［11-12］的作用。研究表明甲氟喹可以诱导Hela 细胞凋亡，伴随着线粒体膜电位增加，活性氧水平上升，ATP 水平降低，mTOR 信号通路被抑制［4］。Sukhai 等［13］采用甲氟喹作用于急性白血病细胞，发现其通过渗透入白血病细胞的溶酶体中，破坏溶酶体蛋白，进而有选择性地杀死白血病细胞及干细胞。应用多种喹啉药物对乳腺癌细胞进行药物毒性实验，发现甲氟喹的效果好于其他喹啉类化合物，如环丙沙星和左氧氟沙星［14-15］。甲氟喹对MDA-MB-231 细胞具有诱导凋亡的作用，同时它能作用于细胞溶酶体，使溶酶体内pH值改变，致使溶酶体内的多种活性酶失活，不能发挥正常功能，进而影响细胞生物体自噬进程［16］。因而，我们选择甲氟喹为研究对象，探究其对脑胶质瘤U251 细胞的作用。本研究发现甲氟喹作用后的U251 细胞增殖能力明显下降，提示甲氟喹能够抑制U251细胞增殖。

图3 甲氟喹联合6 Gy X射线作用后第3天U251细胞的活性氧水平Fig.3 ROS level in U251 cells on the third day after being treated with mefloquine and 6 Gy X-ray

图4 GSH处理后甲氟喹联合X射线作用后第3天U251细胞凋亡情况（*P＜0.05）Fig.4 Apoptosis rate of U251 cells on the third day after being treatment with GSH(*P＜0.05)

目前脑胶质瘤放疗增敏剂成为研究热点。Zong等［17］用纳米粒子修饰替莫唑胺，实现了对神经胶质瘤的放疗协同效应。Katagi等［18］发现GSK-J4能显著抑制胶质瘤的细胞DNA双链修复基因的表达，与放疗联用提高了动物的存活率。Lu等［19］研究了5个稀土氧化物纳米粒子的细胞毒性和放疗增敏效果。本研究以增敏比SER为指标，通过绘制细胞存活曲线，计算D0和SER，研究甲氟喹对U251细胞的放疗增敏效果。结果表明，甲氟喹可以增加U251细胞对X射线的敏感性，20、40 μmol/L甲氟喹的放射增敏比分别为1.44和1.64。同时，本研究发现甲氟喹能够增加U251细胞的凋亡率，且这一效应幅度在X射线照射后会显著增加。

活性氧是一些高活泼的含氧化学物质的统称，正常细胞内含有一定含量的活性氧，但活性氧升高会导致细胞凋亡或者其他损伤。研究表明活性氧含量升高能够使线粒体通透性转运孔开放，导致细胞色素C 释放，从而诱导细胞凋亡［20］；细胞内质网应激时也会产生大量的活性氧，诱发细胞凋亡，这些结论说明活性氧与细胞凋亡有着重要联系。为此，本论文研究了甲氟喹照射组和照射组的U251细胞的活性氧水平，并通过活性氧清除剂GSH 探索甲氟喹对于细胞照射后凋亡率增加与活性氧水平的关系。研究发现X 射线照射后U251 细胞活性氧水平升高，甲氟喹联合辐照U251细胞提高的凋亡率可通过活性氧清除剂GSH 处理得到显著降低，此结果提示活性氧水平上升是甲氟喹联合X射线作用后诱导U251细胞凋亡的机制之一。Liu 等［21］在研究纳米银粒子对胶质瘤的放疗增敏效应时，发现纳米银粒子联合X射线能够诱导胶质瘤细胞活性氧水平增加，并且细胞凋亡率也随活性氧水平上升而增加。姚建新等［16］证实荜茇明碱能增加X 射线照射后MDA-MB-231 细胞内的活性氧水平，促进细胞凋亡。本研究结果与上述研究结果类似，提示活性氧水平增加是甲氟喹增加X射线作用后U251细胞凋亡率上升的的机制之一。

综上所述，甲氟喹能够抑制人脑胶质瘤U251 细胞的增殖，增强U251细胞放射敏感性，其作用机制可能与增加细胞内活性氧水平有关。本文对甲氟喹的增敏机制作了初步探索，但对其具体转换分子机制并不清楚，需要进行后续探索。本研究为以后深入探究甲氟喹的抗癌作用提供了基础，为提高癌症的放射治疗效果提供了新思路。