超高效液相色谱-串联质谱法分析氟啶胺在冬瓜上的残留行为

靖俊杰, 贾春虹, 赵尔成, 余苹中,贺 敏, 陈 莉, 王 东

(北京市农林科学院 植物保护环境保护研究所，北京 100097)

冬瓜Benincasa hispida，又称白瓜、枕瓜、广瓜，原产于我国南方和印度，属葫芦科冬瓜属一年生草本植物，富含蛋白质、维生素及矿物质等营养成分，具有降血糖血压、护肾、美容等药用功效，被消费者奉为物美价廉、食药兼用的蔬菜佳品[1-2]。氟啶胺 (fluazinam) 是1988 年由日本石原株式会社中央研究所开发的二硝基苯胺类广谱杀菌剂 (结构式见图式1)，是一种线粒体氧化磷酰化解偶联剂，能够抑制孢子萌发、菌丝生长和孢子形成[3]，对多种病菌有控制作用，不仅可用于防治草莓灰霉病[4]、花生土传真菌病害[5]、茉莉白绢病[6]及辣椒[7]、人参[8]及葱[9]等作物上的病害，同时还可防治柑橘红蜘蛛[10]等虫害。

农药残留联合专家会议 (JMPR) 在2018 年的报告中将植物源中氟啶胺残留定义为氟啶胺[11]，其检测方法有液相色谱 (LC)[12]、大气压电离源气相色谱-串联质谱 (APCI-GC-MS/MS)[13]及超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS)[14]等。关于氟啶胺在冬瓜上的最大残留限量 (MRL) 值美国规定为0.07 mg/kg，欧盟规定为0.01 mg/kg；国际食品法典委员会 (CAC)、韩国、澳大利亚及日本尚未规定氟啶胺在冬瓜上的MRL 值；在中国，氟啶胺虽已在大白菜、马铃薯、黄瓜和苹果等作物上登记，但尚未制定其MRL 值[15]。同时，氟啶胺在冬瓜上的残留行为也未见报道。基于以上调研数据，本研究进行了氟啶胺在冬瓜上的残留分析方法研究，并开展了500 g/L 氟啶胺悬浮剂在冬瓜上的消解和最终残留试验，旨在为该药剂在冬瓜上的使用提供合理建议，为制定氟啶胺在冬瓜上的残留限量标准提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱联用仪 (UPLCMS/MS)：Waters ACQUITY 超高效液相色谱系统和Waters XEVO TQD 三重四极杆质谱仪 (美国Waters 公司)；UMV-2 多管漩涡混合器，北京优晟联合科技有限公司；TDZ5-WS 台式低速离心机和H1650-W 台式高速离心机，湖南湘仪仪器实验开发有限公司；FOSS Homogenizer 2094 型均质机，福斯公司；AG245 电子天平 (1/10 000)，METTLER TOLEDO 公司；Filter Unit 滤膜 (0.22 μm)，美国Waters 公司。

99.6%氟啶胺 (fluazinam) 标准品，马克西姆公司；500 g/L 氟啶胺悬浮剂 (500 g/L fluazinam SC)，日本石原产业株式会社。色谱纯乙腈，Sigma-Aldrich 公司；甲酸，百灵威公司；分析纯氯化钠，北京化工厂；净化剂管 (含150 mg 无水硫酸镁、50 mg N-丙基乙二胺 (PSA))，天津博纳艾杰尔科技有限公司。试验用水均为超纯水。

1.2 试验材料

供试冬瓜Benincasa hispida 品种：串八 (北京)、一串铃 (山东)、白皮冬瓜 (安徽)、春早一号(湖南)、绿皮冬瓜 (云南) 和小冬瓜 (广东)。

1.3 田间试验

按《农药残留试验准则》[16]要求，试验于2017年在北京市、山东省、安徽省、湖南省、云南省和广东省6 地进行。供试药剂为500 g/L 氟啶胺悬浮剂，施药方式为全株喷雾。试验包括最终残留试验和消解动态试验两部分，设空白对照区、最终残留试验低剂量试验区、最终残留试验高剂量试验区和消解动态试验区。样本采集、样品制备、储存等按照《农药登记残留田间试验标准操作规程》[17]执行。

1.3.1 消解动态试验 试验在北京和安徽进行。于冬瓜果实膨大期，冬瓜长至成熟个体一半大小时开始施药，施药剂量为推荐高剂量有效成分375 g/hm2(制剂用量750 mL/ hm2)。分别于施药后2 h 及 1、3、5、7、10、14、21、30 d 随机采样，视冬瓜瓜体大小，每次每小区采集5～10 个 (不少于2 kg) 生长正常的冬瓜。小区边行和每行距离两端0.5 m 内不采样。

1.3.2 最终残留试验 试验设低剂量有效成分250 g/hm2(制剂用量495 mL/ hm2) 和高剂量有效成分375 g/hm2(制剂用量750 mL/ hm2) 两个施药剂量，每个剂量设2 次施药和3 次施药两个处理，每个处理设3 次重复，施药间隔期7 d。采样时间距离最后一次施药的间隔时间分别为5、7和14 d，随机采样，每次每小区采集4～6 个生长正常的冬瓜。另设清水空白对照，处理间设保护带。

1.4 实验室样品制备与保存

将冬瓜表面上附着的杂质与尾丝用干毛刷去除后，用不锈钢刀十字形纵向切成8 块，取不相邻的4 块切成1 cm 左右的小块，混匀，四分法缩分留样1 kg。分别取150 g 样品两份，于 −20 ℃保存，备用。

1.5 检测方法

1.5.1 样品前处理 将冬瓜样品与适量干冰混合，均质后称取10 g 于50 mL 离心管中，加入20 mL乙腈，涡旋提取3 min；加入3.0 g 氯化钠，涡旋1 min，于4 000 r/min 下离心5 min；取1.5 mL 上清液转入2 mL 净化剂管 (含150 mg MgSO4+50 mg PSA) 中，涡旋 1 min 后于 12 000 r/min 下离心3 min；取上清液过0.22 μm 滤膜，待UPLCMS/MS 分析。

1.5.2 检测条件

色谱条件：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm × 100 mm, 1.7 μm)；柱温 40 ℃；流速 0.3 mL/min；进样量3 μL。流动相A 为乙腈，B 为0.1%甲酸水。梯度洗脱程序：0～3 min，10%A+90%B；＞3 min～4.2 min，90%A+10%B；＞4.2 min～5.2 min，10%A+90%B。

质谱条件：电喷雾离子源正离子扫描方式(ESI+)；毛细管电压3.2 kV；离子源温度150 ℃；去溶剂气和锥孔反吹气均为高纯氮气，去溶剂气温度400 ℃，去溶剂气流速700 L/h，锥孔反吹气流速50 L/h；碰撞气为高纯氩气。氟啶胺定量离子对464.98＞373.0，锥孔电压40 V，碰撞能36 V；定性离子对464.98＞337.9，锥孔电压40 V，碰撞能58 V。

1.5.3 标准溶液配制及标准曲线绘制 称取氟啶胺标准品0.05 g (精确至0.000 1 g) 于100 mL 容量瓶中，用乙腈溶解并配制成500 mg/L 的标准母液；继而再用乙腈稀释配制成0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 和 0.5 mg/L 的系列标准溶液，按1.5.2 节的条件测定。以标准溶液的质量浓度 (x) 为横坐标，定量离子峰面积 (y) 为纵坐标，绘制工作曲线。

1.5.4 添加回收试验 向空白冬瓜样品中添加氟啶胺标准溶液，添加水平分别为0.01、0.05、0.1和1 mg/kg，每个水平5 个重复，另设空白对照，按照1.5.1 节前处理方法进行样品前处理，按1.5.2节条件测定，计算添加回收率及相对标准偏差 (RSD)。

2 结果与分析

2.1 方法的准确度和精密度

以氟啶胺标准溶液的质量浓度 (x) 为横坐标，峰面积 (y) 为纵坐标绘制标准曲线，得到氟啶胺线性方程为y = 49 425x + 254.4，相关系数r = 0.998，表明在0.002～0.5 mg/L 范围内，氟啶胺的质量浓度与其峰面积间呈现良好的线性关系。

在0.01～1 mg/kg 添加水平下，氟啶胺在冬瓜中的平均回收率在 8 9%～1 0 9% 之间，R S D在2.8%～12%之间，符合农药残留检测[18]的要求。典型色谱图见图1。

2.2 氟啶胺在冬瓜上的消解规律

消解动态试验结果 (表1) 表明，氟啶胺在冬瓜上的消解规律符合一级反应动力学模型。其中安徽试验点，药后1 和3 d 的残留量数据异常，可能原因是采样过程出现问题，因此未计算在内。从结果看，虽然北京试验点氟啶胺的原始沉积量低于安徽，但两地氟啶胺在冬瓜上的消解半衰期基本一致。

表1 氟啶胺在冬瓜中的消解动态 (n = 3，2017 年)Table 1 Dissipation of fluazinam in wax gourd (n = 3，2017)

2.3 氟啶胺在冬瓜上的最终残留量

最终残留试验结果 (表2) 表明，氟啶胺在冬瓜上的最终残留量随着采收间隔期的延长而降低，随着施药剂量的增大而增加。

表2 氟啶胺在冬瓜中的最终残留量 (n = 3, 2017 年)Table 2 Terminal residue of fluazinam in wax gourd (n = 3, 2017)

3 结论与讨论

本研究建立了超高效液相色谱-串联质谱测定冬瓜中氟啶胺残留的分析方法，平均回收率和相对标准偏差均符合《农作物农药残留试验准则》[18]的要求。

2017 年在北京和安徽两试验点进行的消解动态试验结果显示，500 g/L 氟啶胺悬浮剂按照推荐高剂量有效成分375 g/hm2施药1 次后，氟啶胺在冬瓜上的消解规律符合一级反应动力学模型，消解半衰期为2.04～2.17 d；在北京市、山东省、安徽省、湖南省、云南省和广东省6 地进行的最终残留试验数据显示，500 g/L 氟啶胺悬浮剂两个施药剂量 (有效成分低剂量为250 g/hm2，高剂量为375 g/hm2)、两种施药次数 (2 次和 3 次) 以及 3 个采收间隔期 (5、7 和14 d) 的冬瓜样品中氟啶胺检出率不超过15%，残留量最大值 (HR) 为0.048 mg/kg。农产品中农药残留量受施药次数、施药剂量和采收间隔期等因素影响，本研究中氟啶胺的最终残留结果并未严格遵守上述规律，可能原因是不同试验地点田间样本大小、采样均匀程度、冬瓜品种、气候条件、成熟程度有一定差异，导致氟啶胺在冬瓜上的最终残留量有所不同。

综上所述，为达到防治冬瓜霜霉病同时降低农药残留的目的，推荐500 g/L 氟啶胺悬浮剂用于防治冬瓜霜霉病时按有效成分250 g/hm2(制剂用量495 mL/ hm2) 施药3 次，距末次施药的采收间隔为7 d。