欧山种葡萄果实成熟期酚类物质含量及其合成相关基因表达量的比较

刘思凡，刘子雨，李萍，吴莉，黄浩然，单守明*

(1.宁夏大学农学院，宁夏 银川 750021；2.宁夏大学葡萄酒学院，宁夏 银川 750021)

葡萄浆果中的酚类物质含量丰富，结构复杂。依据其化学结构主要可分为类黄酮酚和非类黄酮酚两大类[1]。酚类物质的含量及其组成成分对于葡萄的果实品质以及葡萄酒的外观、口感、稳定性等有重要影响，其含量和种类在不同的种及品种间表现出显著差异。URCAN 等[2]研究表明，圆叶葡萄中含有较多的鞣花酸类多酚物质。不同品种的圆叶葡萄中鞣花酸含量的变化规律也有所不同[3]。山葡萄中总花色苷的含量高于欧亚种葡萄，以双糖苷为主，而欧亚种葡萄的花色苷则以单糖苷为主[4]。野生白色毛葡萄的总酚含量高于‘雷司令’和‘白羽’[5]。酿酒葡萄品种中的白藜芦醇含量显著高于鲜食葡萄品种[6]。

欧山种葡萄是中国农业科学院植物研究所利用中国野生山葡萄和欧亚栽培品种杂交育成的酿酒葡萄品种，果实品质优良，抗寒、抗病性较好[7]。宁夏贺兰山东麓产区地理条件优越，是公认的酿酒葡萄生长最佳生态区之一[8]。笔者选择贺兰山东麓产区欧山种 6 个红色酿酒品种(品系)为研究对象，对其成熟期酚类物质含量及其合成相关基因苯丙氨酸裂解酶基因(PAL)、肉桂酸–4–羟化酶基因(C4H)、类黄酮 3'–羟化酶基因(F3'H)、类黄酮 3'，5'–羟化酶基因(F3'5'H)相对表达量进行综合分析，以期为宁夏产区筛选较适宜推广的欧山种酿酒葡萄品种(品系)提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为2013 年定植的6 个欧山种红色酿酒葡萄品种(品系)北红、北玫、北玺、北馨、新北醇、北醇。

1.2 方法

试验于2018 年10 月上旬在宁夏贺兰山东麓平吉堡农业科技示范园进行。

选取无病虫害、着生方向一致的葡萄果穗3 穗，在每穗果的中部采集果粒60 粒，除梗后液氮速冻，研磨成粉，置于–80 ℃冰箱保存，备用。

1.2.1 酚类物质的测定

葡萄果实样品单宁的含量采用 Folin–Denis 比色法[9]测定，总酚采用 Folin–Ciocalteu 比色法[9–10]测定。

参照文献[11–12]方法，提取葡萄果实单体酚，测定芦丁、表儿茶素、白藜芦醇、咖啡酸、没食子酸、儿茶素含量。

1.2.2 葡萄果实酚类合成相关基因表达量的测定

葡萄果实样品中总RNA的提取按照TIANGEN RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒说明书进行。以总RNA 为模板，用Takara PrimeScript TM RT regent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real–Time)试剂盒进行反转录与纯化。选取EF 基因为内参基因，基因PAL、C4H、F3'H、F3'5'H 的引物如表1 所示，由上海生工生物工程有限公司设计完成。

PCR 反应体系 25 µL：模板 DNA 1 µL(模板浓度 200 ng/µL)，上、下游引物各 0.5 µL，2×UltraSYBR Mixture(CWBIO) 12.5 µL，ddH2O 10.5 µL。反应程序采用2 步法：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火/延伸 1 min，40 个循环。每次循环第2步进行荧光采集，以ddH2O 代替cDNA 的NTC 为对照，所有PCR 反应设置3 次生物学重复。试验结果参照 HASHIMTO 等[13]的方法，用 2–△△Ct对数据进行定量分析。

表1 qRT-PCR 引物序列Table 1 Primer sequences of real-time fluorescence quantitative PCR

1.3 数据处理

运用DPS 7.05、Excel 2007 和Sigma Plot 12.5处理和分析试验数据。

2 结果与分析

2.1 欧山种酿酒葡萄果实酚类物质的含量

2.1.1 不同品种(品系)间总酚和单宁含量的差异

由表2 可以看出，北红葡萄果实总酚和单宁含量最高，分别为13.60 mg/g 和4.69 mg/g，与其余品种(品系)的差异显著，北醇总酚含量最低，仅为3.15 mg/g；除北红外，其余品种(品系)单宁含量均较低。

2.1.2 不同品种(品系)间白藜芦醇含量的差异

欧山种葡萄果实中白藜芦醇含量都较低，含量为0.08～4.90 mg/kg，平均含量1.04 mg/kg。北红果实中白藜芦醇含量显著高于其余品种(品系)的，达到4.9 mg/kg，北玺的白藜芦醇含量仅为北红含量的19%，但也显著高于其余4 个品种(品系)的。

2.1.3 不同品种(品系)间酚酸类物质含量的差异

北红果实中咖啡酸和没食子酸的含量均最高，分别为5.92 mg/kg 和3.15 mg/kg；北玺果实中酚酸含量与北玫、北馨咖啡酸和没食子酸含量差异不显著，但显著高于其余 3 个品种(品系)；北馨果实中没食子酸含量较高，为2.17 mg/kg，其咖啡酸含量最低，仅为0.56 mg/kg；北玫果实中没食子酸和咖啡酸含量分别为1.83 mg/kg 和0.98 mg/kg，咖啡酸和没食子酸总量仅低于北红和北玺。

2.1.4 不同品种(品系)间黄酮类物质含量的差异

欧山种葡萄果实的芦丁含量都较高，北红芦丁含量最高，为28.35 mg/kg，与其余品种(品系)的差异显著。葡萄果实中儿茶素含量远高于表儿茶素，北红表现差异最显著，北玺果实中表儿茶素含量仅低于北馨的，为 8.79 mg/kg，儿茶素含量为 17.53 mg/kg，显著低于北红和北醇的；北馨果实中表儿茶素含量显著高于其他品种的，为9.49 mg/kg；北玫果实中表儿茶素和儿茶素含量均较低，北醇 11号果实中儿茶素含量较高，为19.2 mg/kg，表儿茶素含量较低，为2.05 mg/kg；新北醇果实中表儿茶素含量显著高于北醇，儿茶素含量显著低于北醇的。

表2 供试欧山种酿酒葡萄品种(品系)果实中酚类物质的含量Table 2 Polyphenols content in fruits of different wine grape varieties

2.2 欧山种酿酒葡萄果实酚类物质合成相关基因的相对表达量

由图1 可知，6 个葡萄品种(品系)中，北红PAL和C4H 基因相对表达量均最高，而北玫PAL 和C4H基因相对表达量均最低。与对照新北醇相比，北馨PAL 基因的表达上调，C4H 基因的表达下调，PAL相对表达量显著高于C4H 的；北玺PAL 和C4H 基因的相对表达量均上调，但C4H 的相对表达量显著高于PAL 的；北醇PAL 和C4H 基因均表达上调。

与对照相比，北玺F3'H 和F3'5'H 基因的表达均上调且相对表达量较高，北醇、北红F3'H 基因的表达均上调，F3'5'H 基因的表达下调；北醇F3'5'H 表达下调，北玫和北馨F3'H 和F3'5'H 基因表达均下调。

图1 欧山种酿酒葡萄果实酚类物质合成相关基因的相对表达量Fig.1 Comparison of expression levels of phenolic compounds related genes in fruit of hybrid of Vitis vinifera and Vitis amurensis wine grapes during maturity

2.3 欧山种酿酒葡萄果实酚类物质合成相关基因转录水平与单体酚含量的相关性

欧山种葡萄果实单体酚含量与酚类物质合成相关基因相对表达量的相关系数(表3)表明：北红葡萄咖啡酸和表儿茶素含量与 F3'5'H 基因相对表达量呈显著正相关，相关系数均为0.99；芦丁含量与C4H 基因相对表达量呈显著正相关，相关系数为0.99。北玺葡萄芦丁含量与C4H 基因和F3'5'H 相对表达量分别呈显著、极显著正相关，相关系数分别为 0.99 和 1.00。

表3 北红和北玺葡萄果实单体酚含量与合成相关基因相对表达量的相关系数Table 3 Correlation coefficients between the monomeric phenols in Be ihong and Be ixi gr ape f ruit and the r elative expression of synthetic related genes

3 讨论

葡萄果实中的酚类物质成分高度依赖葡萄品种，对葡萄酒的外观、收敛性、入口性和保健性以及酒体质量起决定性作用[14]。JEANDET[15]研究结果表明，白藜芦醇含量与品种密切相关，并在果实成熟过程中不断减少。本研究结果表明，欧山种葡萄果实的白藜芦醇含量为0.08～ 4.90 mg/kg，平均含量为1.04 mg/kg；没食子酸含量相较于咖啡酸含量在葡萄品种(品系)中差异较大，这与MOSKOWITZ[16]

研究结果相一致。黄酮醇类物质的含量较高，北红积累的类黄酮物质(芦丁)含量较多，相比于欧亚种葡萄中(儿茶素和表儿茶素)[17]，欧山种葡萄中的远低于欧亚种葡萄的。

葡萄成熟过程中，葡萄果实中酚类物质通过苯丙氨酸代谢途径持续积累。酚类物质的种类和含量在不同葡萄种、品种、品系间呈显著差异，这主要与葡萄果实中酚类合成基因的调控有关，花色苷合成主要受到PAL、C4H、F3'H、F3'5'H 等基因的调控。欧山种葡萄除北玫外，其余品种与对照新北醇相比PAL 基因表达均上调，北红PAL 基因相对表达量是对照的 20 倍以上，这与孙润泽等[18]研究结果相似。C4H 基因表达上调，可以增加苯丙烷代谢酚酸类物质(香豆酸、阿魏酸和咖啡酸)的合成[19]，酚酸类物质与 C4H 基因呈现相关性，但本研究中北红、北玫的咖啡酸含量与C4H 基因相关程度低，可能是欧山种葡萄综合抗性比欧亚种葡萄强，不完全依靠肉桂酸–4–羟化酶合成的香豆酸、阿魏酸和咖啡酸等病原菌抑制物，也能在不利条件下进行正常的生长发育。F3'H 和F3'5'H 在类黄酮合成途径中分别参与合成二氢槲皮素和二氢杨梅酮，二者进而形成花青素和花萃素类花色苷。赵权[20]研究发现双红山葡萄成熟期F3'5'H 转录水平高于F3'H 的转录水平。而在本试验中，只有北玫表现与双红相似，其余品种(品系)均表现相反的情况，这可能与品种特性、产地和年份等有关。