萨梅诺娃新佩雷斯虫中国新记录

刘新华 翁美其 宋 锐 赵媛莉 章晋勇,4* 肖调义

(1.湖南农业大学动物科学技术学院,长沙 410128;2.中国科学院水生生物研究所淡水生态与生物技术国家重点实验室,农业农村部淡水养殖病害防治重点实验室,淮安研究中心,武汉 430072;3.中国科学院大学,北京 100049;4.青岛农业大学海洋科学与工程学院,青岛 266109;5.湖南省水产科学研究所,长沙 410153)

微孢子虫是一类在自然界中广泛存在的、形成孢子的专性细胞内寄生虫,主要寄生于昆虫、鱼类、哺乳动物和甲壳类等[1,2]。摇蚊幼虫生活于自然水体底部,常钻入底泥中,以有机碎屑和腐败物质为食,从而容易摄入底泥中的成熟孢子而发生感染[3]。目前,摇蚊幼虫已成为微孢子虫重要宿主之一,全球已报道约50余种摇蚊幼虫微孢子虫[4,5]。我国水生微孢子虫的研究主要集中于鱼类或甲壳类经济动物,如寄生于南美白对虾肝胰腺的虾肝肠孢虫(Enterocytozoon hepatopenaeiTourtip,et al.2009)、寄生于中华绒螯蟹肝胰腺的中华绒螯蟹肝孢虫(Hepatospora ericheriorStentiford,et al.2013)、寄生于珍珠龙胆肠道上皮细胞核内的石斑鱼肠孢虫(Enterospora epinepheliYan,et al.2018)、寄生于真鲷腹腔的真鲷格留虫(Glugea pagriSu,et al.2014)等,而在摇蚊幼虫上至今仍没有相关报道[6—10]。基于此,作者于2017年11月至2018年8月对我国养殖池塘中摇蚊幼虫微孢子虫感染情况进行初步调查,发现一种寄生于羽摇蚊幼虫脂肪体的微孢子虫,通过形态学、透射电镜观察以及分子生物学分析,鉴定其为萨梅诺娃新佩雷斯虫(Neoperezia somenovaiaeIssi,et al.2012)。本研究是萨美诺娃新佩雷斯虫在国内的新记录和中国首例摇蚊幼虫微孢子虫报道。

1 材料与方法

1.1 样本采集及处理

于2017年11月至2018年8月在江苏洪泽异育银鲫养殖场(33°21′20″N,118°52′47″E)收集到羽摇蚊幼虫120尾(体长5.3—7.6 cm),活体运输至当地鱼病研究室观察。

1.2 活体检查

首先,肉眼观察带回的摇蚊幼虫,当发现有疑似感染个体时,取少量病灶组织进行压片观察确认,并在1000×倍下镜检对新鲜孢子进行观察、测量和拍照。同时分离感染的脂肪体组织分别保存在95%酒精以及2.5%中性戊二醛中,以用于后续的分子分析与电镜观察。

1.3 超微结构观察

将感染的脂肪体组织保存到2.5%中性戊二醛中,4℃固定24h,磷酸缓冲液冲洗,经1%锇酸固定和磷酸缓冲液漂洗后,再经系列丙酮脱水,渗透、包埋和切片后经醋酸铀和柠檬酸铅双重染色,HITACHI H-7700透射电镜观察超微结构,工作电压为80 KV。

1.4 DNA提取、18SrDNA序列的扩增和测定

取酒精保存的感染组织,剪碎后用磷酸盐缓冲液洗涤两次以去除残余酒精。加入600 μL磷酸缓冲液和适量酸洗玻璃珠(直径0.1 mm),用样本快速匀浆仪Fast Prep-24 5G(MP,美国)破碎孢壁,6.0速率振荡4次,每次20s。镜检观察孢子是否完全破碎。破碎后利用细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(Qiagen,德国)提取样品基因组DNA。羽摇蚊鉴定用真核生物COⅠ通用引物LCO1490(5′-GGTCA ACAAATCATAAAGATATTGG-3′)与HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′)进行扩增[11],PCR反应体系为50 μL,其中DNA 2 μL、1× PCR mixture 25 μL(康为,北京),正反引物各2 μL(10 μm)。反应条件为94℃预变性2min;94℃变性30s;50℃退火30s;72℃延伸1min,35个循环;72℃终延伸10min。微孢子虫用其18S rDNA通用引物V1F(5′-CACCAGGTTGATTCTGCCTGAC-3′)与1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行扩增[12,13],PCR反应体系为50 μL,包括2 μL DNA、25 μL 1×PCR mixture(康为,北京)、正反引物各2 μL(10 μm),最后补加双蒸水至50 μL。反应程序为94℃预变性3min;94℃变性40s;50℃退火30s;72℃延伸2min,35个循环;72℃终延伸10min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳,用胶回收试剂盒(康为,北京)纯化回收,将目的片段连接到pMD18-T载体(TaKaRa,日本),再转化到感受态细胞DH5α中,50 μL/mL氨苄青霉素的LB 固体培养基均匀涂布并培养过夜,挑取阳性克隆,用于测序。测序在自动测序仪ABI PRISM®3730 DNA Sequencer(Applied Biosystems USA)上完成。测序结果通过BioEdit进行拼接[14],并根据测序峰图进行人工校正(DNASTAR INC.,Madisom,Wis),将拼接完毕的序列提交至Gen-Bank。

1.5 系统发育关系及遗传距离分析

将所获得序列通过NCBI网站进行BLAST比对,并从GenBank上选取相似性较高的种类18S rDNA序列数据进行系统发育树的构建,选取Trichonosema pectinatellae(AF484695)为外类群。利用CLUSTAL 1.8[15]对进行多重比对,分别利用最大似然法(Maximum Likehood,ML)和贝叶斯法(Bayesian Inferences,BI)进行系统发育关系分析。通过jModelTest[16]挑选最佳核苷酸替代模型应用于ML和BI分析。ML分析利用PhyML 3.0[17]软件进行运算100代。BI分析利用Mr.Bayes[18]软件进行操作,以随机树(Random)为起始树,替换模型参数Nst为6,马尔科夫链的蒙特卡洛方法(Markov chain Monte Carlo process)设置为4条链同时运行1000000代。获得的系统发育树用Figtree v1.4.4(http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/)和Adobe Illustrator(Adobe Systems Inc.美国)编辑、注释。

2 结果

2.1 宿主鉴定及形态描述

扩增获得摇蚊COⅠ基因709 bp,将其提交到GenBank(序列号:MN750315),BLAST比对发现其与羽摇蚊序列(JF412099)相似性为98.2%,在种内范围之内,表明宿主为羽摇蚊幼虫。

摇蚊感染萨梅诺娃新佩雷斯虫个体可见脂肪体组织明显白浊(图1A),感染率为12.5%(15/120)。成熟孢子呈卵圆形,孢子长(5.7±0.2)μm(5.3—6.3 μm),宽(3.7±0.1)μm(3.4—4.0 μm,图1B、1C)。

2.2 超微结构

透射电镜观察显示发育阶段均为离核,与宿主细胞质直接接触,无产孢囊或寄生囊泡状结构,各发育阶段发育不同步(图2)。早期单核裂殖体阶段未观察到,仅发现一些高电子密度的多核裂殖体(图2A),经原生质团分裂形成单核或多核产孢体,进一步发育为孢子母细胞(图2B、2C)。孢子母细胞形状不规则,与宿主细胞质直接接触,周围被内质网环绕。随着发育的进行可见极丝、孢壁以及锚状盘等微孢子虫的典型结构。成熟孢子卵圆形,离核,细胞核较大,位于孢子正中央,细胞核周围被大量核糖体围绕(图2D—F)。极质体分为两部分,前半部分为中空格子状,后半部分薄膜状(图2G)。锚状盘位于孢子前端,呈蘑菇状。孢壁三层,外层为高电子密度层,厚26.5—62.7 nm,中层为电子透明层,厚151.8—236.1 nm,最里层为质膜层(图2H)。同型极丝,30—31圈,分2—3列排列(图2D)。后泡较小,位于孢子的末端(图2E)。

图1 萨梅诺娃新佩雷斯虫光镜观察Fig.1 Observation of Neoperezia semenovaiae by light microscope

图2 萨梅诺娃新佩雷斯虫透射电镜观察Fig.2 Electron micrographs of spores of N. semenovaiae

2.3 分子序列分析

通过分子克隆获得2条1356 bp 18S rDNA序列,GC含量43.8%,二者间相似性为99.8%。将获得序列与相似性较高的种类进行相似性与遗传距离分析发现(表1),遗传距离最近的为N. semenovaiae(0.0076/99.2%,HQ396520),其他相似的种类还有:N. chironomi(0.0324/96.8%,HQ396519),Schroedera airthreyi(0.0396/96.1%,AJ749819),Brynosemaplumatellae(0.0452/95.5%,AF484692)。系统发育关系分析发现本研究所报道的微孢子虫与Neoperezia、Bryonosema及Schroedera属种类聚为一枝;Neoperezia semonovaiae中国种群先聚为一个分支后,再与俄罗斯种群聚类,支持率高(图3)。

图3 基于18S rDNA基因序列构建的贝叶斯(BI)系统发育树(分子节点数值分别表示BI和ML的分枝支持率)Fig.3 Phylogenetic tree of N. semenovaiae generated by Bayesian inferences(BI)based on the partial 18S rDNA sequences(Numbers at branch nodes indicate the support values of Bayesian inferences(BI)and maximum likelihood(ML)support values)

表1 基于18S rDNA对萨梅诺娃新佩雷斯虫与相似性较高种类的相似性(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)Tab.1 Comparison of similarities(above diagonal)and genetic distances(below diagonal)of N. semenovaiae with other most similar species based on the partial 18S rDNA

分类学信息:

萨梅诺娃新佩雷斯虫Neoperezia semenovaiaeIssi,et al.2012

宿主:羽摇蚊幼虫Chironomus plumosuslarva

采样地点:江苏洪泽异育银鲫养殖场(33°21′20″N,118°52′47″E)

寄生部位:脂肪体

宿主大小:体长5.3—7.6 cm

感染率:12.5%(15/120)

样本保存:2.5%戊二醛与95%酒精固定标本保存于中国科学院水生生物研究所鱼病研究室,标本号:MTR201712291、MTR201712292.

序列号:萨梅诺娃新佩雷斯虫(MN512229,MN512230),羽摇蚊(MN750315)。

3 讨论

传统微孢子虫的分类学研究主要基于不同发育阶段的形态学特征,由于不同发育阶段形态特征复杂,同种、属间也存在显著差异,特别是一些具有多态性的种类,易造成冗余种属的出现,如此前一种寄生于苔藓虫的种类(Pseudonosema cristatellae)因其发育阶段出现藕核而错误的鉴定为Nosema cristatellae[19];Amblyospora属种类生活史需要多个宿主完成,具多态性,在不同宿主中不同发育阶段的形态学特征差异显著,常被鉴定为不同的种类[20]。随着现代分子生物学手段的发展,上述问题得到有效的解决,结合不同发育阶段的形态特征、生态特征(寄主生境与寄生部位)及分子特征已成为微孢子虫分类学研究的标准方法[1,2]。

N. semenovaiae因其孢子具有二态性,早先被错误的鉴定为Semenovaiae chironomi,与Neoperezia分别归属于两个不同科中[21,22]。近期,俄罗斯学者应用现代分子生物学与传统分类学手段相结合的方法对S. chironomi进行重新鉴定,发现S. chironomi与N. chironomi应为同属种类,根据命名先后顺序,取消了Semenovaiae属,并将Semenovaiae chironomi重命名为N. semenovaiae[23]。本研究发现的种类各发育阶段形态特征与Neoperezia属种类一致[21],如宿主相同,成熟孢子为卵圆形,极丝圈数较多,细胞核较大等。目前,Neoperezia属种类已报道两种,分别为N. chironomi和N. semenovaiae(表2)。N. chironomi寄生于宿主躯体所有脂肪体组织,本文描述的种类只发现寄生于躯体前段的脂肪体组织[19,20]。此外,其极丝圈数比N. chironomi更多(30—31vs.24—27),二者在孢子大小上也有明显差别。透射电镜发现萨梅诺娃新佩雷斯虫早期发育阶段较少,未发现孢子二态型,产孢体、孢子母细胞以及成熟孢子超微结构特征与N. semenovaiae相似。另外,BLAST比对发现其与N. semenovaiae序列相似性为99.1%,进一步证实二者应为同种。值得注意的是,在我国发现的N. semenovaiae所有发育阶段均是与宿主细胞质直接接触,未观察到产孢囊结构,而俄罗斯科学家之前证实其在产孢体、孢子母细胞以及成熟孢子时期出现产孢囊结构,这可能是由于其产孢囊结构较薄、不易观察所导致[23]。

表2 萨梅诺娃新佩雷斯虫与已报道的新佩雷斯属种类形态特征比较Tab.2 Morphological comparison of Neoperezia semenovaiae with other reported Neoperezia spp.

系统发育关系分析发现萨梅诺娃新佩雷斯虫与新佩雷斯虫、苔藓虫微孢子虫(Bronosema plumatellae、Schroedera plumatellae及Schroedera airthreyi)聚为一个独立进化枝,表明新佩雷斯虫与一些苔藓虫微孢子虫可能来源于共同祖先。进一步分析发现,萨梅诺娃新佩雷斯虫中国种群先聚为一个支系,然后与俄罗斯种群进行聚类,表明地理隔离已对该物种造成了分化,但其祖先种究竟起源于中国还是俄罗斯仍需进一步的研究。此外,羽摇蚊幼虫广泛分布于我国不同省份水域,调查我国不同区域羽摇蚊幼虫是否感染N. semenovaiae及感染后在形态学与分子水平上是否已发生分化也是我们未来需要关注的方向之一。

综上所述,本文报道了我国首例摇蚊幼虫微孢子虫,结合形态学特征、生态学特征以及分子特征将其鉴定为萨梅诺娃新佩雷斯虫。