长基因间非编码RNA 00689靶向miR-876-5p调控膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的机制

杨文博 许振丹 耿帅

新乡市中心医院1泌尿外二科，2风湿免疫科，3麻醉手术部（河南新乡453000）

膀胱癌（bladder cancer，BC）是人类最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一。据统计，我国膀胱癌年新增病例数约8 万例，死亡病例达3.3 万例［1］。尽管尿道或膀胱切除术、术后膀胱内辅助化疗降低了膀胱癌复发率，但BC 患者预后仍较差。因此，了解膀胱癌进展涉及的分子机制、开发新的治疗策略以改善膀胱癌患者临床结局显得十分迫切。长链非编码RNA（lncRNA）是长度大于200 个核苷酸的非蛋白编码RNA 转录本，其通过与微小RNA（miRNAs）、mRNA和蛋白相互作用发挥生理功能［2］。异常表达的lncRNA 可作为癌基因或抑癌基因，参与肿瘤发生和转移［3-4］。近期研究发现，lncRNA长基因间非蛋白编码RNA 00689（LINC00689）高表达与胶质瘤大小、分级、患者预后密切相关，敲减LINC00689 明显抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和糖酵解，抑制体内肿瘤生长［5］。序列分析发现，LINC00689 对miR-876-5p 具有潜在靶向调控作用。miR-876-5p 已被证实在乳腺癌、肝癌、肺癌等恶性肿瘤中表达抑制肿瘤细胞的增殖和转移［6-8］。然而，LINC00689、miR-876-5p在膀胱癌中作用知之甚少。本研究通过检测膀胱癌组织中LINC00689、miR-876-5p表达水平，分析二者在膀胱癌细胞T24增殖和凋亡中的作用，验证LINC00689 对miR-876-5p调控作用，以期为膀胱癌治疗提供候选靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂膀胱癌细胞T24、正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1 购于美国典型培养物保藏中心；Rever Tra Ace qPCR 逆转录试剂盒购于日本TOYOBO 公司；miRNA 逆转录试剂盒购自美国Gene Copoeia 公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ购于日本Takara 公司；小干扰RNA（si-RNA）、过表达质粒（pcDNA-RNA）、miRNA 模拟物（mimics）、miRNA 抑制物（anti-miRNA）以及各组阴性对照、双荧光素酶报告载体购自广州锐博生物公司；细胞计数试剂盒（CCK-8）购自上海研谨生物科技公司；膜联蛋白V 异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒购于上海翊圣生物公司；兔源磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、细胞周期素D1（CyclinD1）、p21、B 细胞淋巴瘤（Bcl-2）、Bc 相关X蛋白（Bax）一抗以及羊抗兔IgG 二抗购于上海赛信通生物公司。

1.2 组织来源选取2015 年5 月至2018 年1 月于我院行手术切除的39 例膀胱癌患者的癌组织病理标本及癌旁组织标本（距离肿瘤边缘＞3 cm 的正常膀胱黏膜组织），其中男29 例，女10 例，年龄40 ～75 岁，平均61.5 岁。所有患者术前未接受放疗或化疗等辅助治疗。术中切除的癌组织、癌旁组织置于-80 ℃液氮中储存。本研究经我院伦理委员会批准同意，所有患者均知情同意。

1.3 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析LINC00689和miR-876-5p表达TRIzol试剂提取膀胱癌组织、癌旁组织中总RNA，Nanodrop 2000 测量RNA 浓度。对于lncRNA检测使用ReverTra Ace qPCR逆转录试剂盒将RNA 反转录为cDNA。对于miRNA 检测使用miRNA 逆转录试剂盒进行逆转录。使用SYBR Premix Ex TaqⅡ进行RT-qPCR。LINC00689引物（上游：5′-GCTCACTGCAACCTCTGTCT-3′，下游5′-CACCAGGAACATCCAGGACC-3′）；GAPDH 引物（上游：5′-GGGTCTTATGACCACTGTCC-3′；下游5′-GTAAGCT TCCCATTCAGCTCAG-3′）；miR-876-5p 引物（上游5′-TGAAGTGCTGTGGATTTCTTTGTG-3′，下游5′-TGAATTACTTTGTAAACCACCACCA-3′）；U6 引物（上游5′-GACGAATACCGGCGTGAGAA-3′，下游5′-AAATTCTGTTTGCGGTGCGT-3′）。

1.4 细胞转染和实验分组T24细胞用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清、1%青链霉素）置于37 ℃、5%的CO2的湿润培养箱中培养。细胞80%融合时加入胰酶消化传代。将对数期T24细胞接种6孔板，利用Lipofectamine 3000试剂将si-NC、si-LINC00689、miR-NC、miR-876-5p mimics 分别转染50%融合细胞，依次命名为si-NC 组、si-LINC00689 组、miR-NC组、miR-876-5p组。转染48 h后按照上述RT-qPCR方法检测转染效果，随后进行功能分析。为证实LINC00689 是通过靶向调控miR-876-5p 发挥作用，将si-LINC00689 分别与anti-miR-NC、anti-miR-876-5p共转染T24细胞，依次命名为si-LINC00689+antimiR-NC 组、si-LINC00689+anti-miR-876-5p 组，转染48 h 后进行后续实验。

1.5 双荧光素酶报告实验使用Lipofectamine2000将WT-LINC00689、MUT-LINC00689 与miR-876-5p或miR-NC 共转染到T24 细胞，转染48 h 后收获细胞，双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性。并将pcDNA、pcDNA-LINC00689、si-NC、si-LINC00689 分别转染T24 细胞，转染48 h 后收获细胞，RT-qPCR 检测miR-876-5p 表达水平。

1.6 CCK-8 法检测细胞增殖活力将各转染组

T24 细胞接种到96 孔板，培养箱中孵育48 h，每个孔中加入10 μL CCK-8 试剂，并在培养箱中继续培养1 h。然后，用酶标仪在450 nm 的波长处测量每个孔的吸光度（OD）以表示细胞活力。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡胰蛋白酶化各转染组T24 细胞，用Annexin V 结合缓冲液重悬细胞，按照凋亡检测试剂盒步骤用FITC Annexin V 和PI进行双染色。流式细胞仪检测细胞凋亡比例。

1.8 蛋白质免疫印记（Western blot）检测CyclinD1、p21、Bcl-2、Bax蛋白表达水平用RIPA缓冲液裂解细胞，二喹啉甲酸试剂盒对蛋白质浓度进行定量。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的蛋白，然后转移至聚偏二氟乙烯膜。以GAPDH抗体（1∶2 000）作为对照，加入特异性一抗溶液（均为1∶1 000）4 ℃下孵育膜过夜，然后与对应二抗（1∶2 500）室温孵育1 h。电化学发光显色，ImageJ 软件分析目的蛋白相对表达量（目的蛋白与GAPDH 条带灰度值比值）。

1.9 统计学方法所有实验均设置3 个平行实验，独立重复3 次。采用SPSS 17.0 进行统计学分析，数据以均数±标准差表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析和LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LINC00689和miR-876-5p在膀胱癌组织和细胞中的表达膀胱癌组织中LINC00689表达较癌旁组织显著升高，miR-876-5p表达较癌旁组织显著降低（P＜0.05），见图1A、1B。T24 细胞中LINC00689表达较SV-HUC-1 细胞显著升高，miR-876-5p 表达较SV-HUC-1细胞显著降低（P＜0.05），见图1C、1D。

2.2 抑制LINC00689 表达对膀胱癌T24 细胞增殖的影响与si-NC组比较，si-LINC00689组T24细胞LINC00689表达量显著降低，细胞活力、CyclinD1蛋白表达量显著降低，p21 蛋白表达量显著升高（P＜0.05）。见表1、图2。

2.3 抑制LINC00689 表达对膀胱癌T24 细胞凋亡的影响与si-NC 组比较，si-LINC00689 组T24 细胞凋亡率、Bax 蛋白表达量显著升高，Bcl-2 蛋白表达量显著降低（P＜0.05）。见表2、图3。

图1 LINC00689 和miR-876-5p 在膀胱癌组织和细胞中的表达Fig.1 Expression of LINC00689 and miR-876-5p in bladder cancer tissues and cells

表1 抑制LINC00689 表达对膀胱癌T24 细胞增殖的影响Tab.1 Effect of inhibition of LINC00689 expression on proliferation of T24 cells in bladder cancer ±s

表1 抑制LINC00689 表达对膀胱癌T24 细胞增殖的影响Tab.1 Effect of inhibition of LINC00689 expression on proliferation of T24 cells in bladder cancer ±s

注：与si-NC 比较，*P ＜0.05

分组si-NC si-LINC00689 t值P值LINC00689 1.00±0.08 0.53±0.04*15.764＜0.001 OD值（450 nm）0.69±0.05 0.34±0.03*18.007＜0.001 CyclinD1蛋白0.71±0.05 0.31±0.03*20.580＜0.001 p21蛋白0.23±0.02 0.66±0.05*23.955＜0.001

图2 抑制LINC00689 表达对膀胱癌T24 细胞增殖相关蛋白表达的影响Fig.2 Effect of inhibition of LINC00689 on expression of proliferation-related proteins in bladder cancer T24 cells

表2 抑制LINC00689 表达对膀胱癌T24 细胞凋亡的影响Tab.2 Effect of inhibition of LINC00689 expression on apoptosis of T24 cells in bladder cancer±s

表2 抑制LINC00689 表达对膀胱癌T24 细胞凋亡的影响Tab.2 Effect of inhibition of LINC00689 expression on apoptosis of T24 cells in bladder cancer±s

注：与si-NC 比较，*P ＜0.05

分组si-NC si-LINC00689 t 值P 值凋亡率（%）7.67±0.46 21.34±2.05*19.519＜0.001 Bcl-2 蛋白0.82±0.06 0.37±0.03*20.125＜0.001 Bax 蛋白0.14±0.02 0.57±0.04*28.845＜0.001

2.4 LINC00689 靶向调控miR-876-5p 的表达Star Base 预测LINC00689 靶基因显示，LINC00689与miR-876-5p 存在互补结合位点，见图4。荧光素酶活性检测显示，与转染miR-NC 比较，转染miR-876-5p 可降低WT-LINC00689 的荧光素酶活性［（1.02±0.07）vs.（0.59±0.05），P＜0.05］，而对MUT-LINC00689 的荧光素酶活性无显著影响［（1.00 ±0.07）vs.（0.99±0.06），P＞0.05］。与pcDNA组比较，pcDNA-LINC00689组T24细胞miR-876-5p表达水平显著降低［（1.00±0.05）vs.（0.63±0.04），P＜0.05］；与si-NC 组比较，si-LINC00689 组T24 细胞miR-876-5p 表达水平显著升高［（1.02 ± 0.06）vs.（3.07 ±0.25），P＜0.05］。

图3 抑制LINC00689 表达对膀胱癌T24 细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of inhibition of LINC00689 expression on apoptosis of T24 cells in bladder cancer

2.5 miR-876-5p 过表达对膀胱癌T24 细胞增殖和凋亡的影响与miR-NC 组比较，miR-876-5p 组T24 细胞miR-876-5p 表达量显著升高，细胞活力、CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表达量显著降低，凋亡率、p21 和Bax 蛋白表达量显著升高（P＜0.05），见表3、图5。

图4 LINC00689 的序列中含有与miR-876-5p 互补的核苷酸序列Fig.4 The sequence of LINC00689 contains nucleotide sequences complementary to miR-876-5p

图5 miR-876-5p 过表达对膀胱癌T24 细胞增殖和凋亡的影响Fig.5 Effect of miR-876-5p overexpression on proliferation and apoptosis of bladder cancer T24 cells

表3 miR-876-5p 过表达对膀胱癌T24 细胞增殖和凋亡的影响Tab.3 Effect of miR-876-5p overexpression on proliferation and apoptosis of bladder cancer T24 cells±s

表3 miR-876-5p 过表达对膀胱癌T24 细胞增殖和凋亡的影响Tab.3 Effect of miR-876-5p overexpression on proliferation and apoptosis of bladder cancer T24 cells±s

注：与miR-NC 比较，*P ＜0.05

分组miR-NC miR-876-5p t 值P 值miR-876-5p 1.00±0.05 2.46±0.23*18.609＜0.001 OD 值（450 nm）0.71±0.04 0.39±0.03*19.200＜0.001凋亡率（%）6.97±0.60 19.56±1.68*21.172＜0.001 CyclinD1 蛋白0.72±0.05 0.35±0.03*19.036＜0.001 p21 蛋白0.22±0.02 0.61±0.04*26.162＜0.001 Bcl-2 蛋白0.84±0.05 0.43±0.03*21.094＜0.001 Bax 蛋白0.15±0.02 0.51±0.04*24.150＜0.001

2.6 干扰miR-876-5p表达逆转了抑制LINC00689表达对膀胱癌T24 细胞增殖和凋亡的作用与si-LINC00689+anti-miR-NC 组比较，si-LINC00689+anti-miR-876-5p 组T24 细胞miR-876-5p 表达水平显著降低，细胞活力、CyclinD1 和Bcl-2 蛋白表达量显著升高，凋亡率、p21 和Bax 蛋白表达量显著降低（P＜0.05），见表4、图6。

表4 干扰miR-876-5p 表达逆转抑制LINC00689 表达对膀胱癌T24 细胞增殖和凋亡的作用Tab.4 Interference with miR-876-5p reversed the effect of inhibition of LINC00689 expression on proliferation and apoptosis of bladder cancer T24 cells±s

表4 干扰miR-876-5p 表达逆转抑制LINC00689 表达对膀胱癌T24 细胞增殖和凋亡的作用Tab.4 Interference with miR-876-5p reversed the effect of inhibition of LINC00689 expression on proliferation and apoptosis of bladder cancer T24 cells±s

注：与si-LINC00689+anti-miR-NC 比较，*P ＜0.05

分组si-LINC00689+anti-miR-NC si-LINC00689+anti-miR-876-5p t 值P 值miR-876-5p 1.00±0.07 0.49±0.04*18.977＜0.001 OD 值（450 nm）0.33±0.03 0.58±0.04*15.000＜0.001凋亡率（%）22.14±2.23 11.97±1.06*12.357＜0.001 CyclinD1 蛋白0.30±0.02 0.61±0.04*20.795＜0.001 p21 蛋白0.68±0.05 0.32±0.03*18.522＜0.001 Bcl-2 蛋白0.36±0.03 0.71±0.05*18.007＜0.001 Bax 蛋白0.59±0.04 0.25±0.02*22.808＜0.001

图6 干扰miR-876-5p 表达逆转抑制LINC00689 表达对膀胱癌T24 细胞增殖和凋亡的作用Fig.6 Interference with miR-876-5p reversed the effect of inhibition of LINC00689 expression on proliferation and apoptosis of bladder cancer T24 cells

3 讨论

大量研究显示，lncRNA 表达失调在转录和转录后水平上调节蛋白质编码基因参与细胞增殖、凋亡、转移、耐药等各种生物学过程的调控，在肿瘤形成、进展中具有关键作用［9-11］。本研究结果显示，膀胱癌组织中LINC00689 表达较癌旁组织显著升高，且T24细胞中LINC00689 表达较SV-HUC-1细胞显著升高，提示LINC00689 高表达可能是参与膀胱癌进展的重要因素。采用体外细胞实验进行功能分析发现，转染si-LINC00689 抑制LINC00689表达明显降低膀胱癌细胞T24增殖活力，升高细胞凋亡水平。抑制LINC00689表达后CyclinD1表达降低，p21 表达增加，提示抑制LINC00689 表达可能影响膀胱癌T24 细胞周期从而影响其增殖。此外，本研究显示抑制LINC00689 还显著下调抗凋亡蛋白Bcl-2 表达，上调促凋亡蛋白Bax 表达，这进一步验证抑制LINC00689 表达对T24 细胞的凋亡诱导作用。已有研究表明，LINC00689 高表达不仅影响肿瘤形成，还诱导癌细胞的增殖、迁移、侵袭和上皮间充质转化（EMT），阻碍细胞凋亡，从而在骨肉瘤、胃癌、前列腺癌发展中起致癌lncRNA 作用，抑制LINC00689 表达可抑制癌细胞的恶性生物学行为，是癌症治疗的潜在靶标［12-14］。以上结果表明，LINC00689 在膀胱癌进展中具有致癌作用。

近年研究［15］发现，lncRNA充当分子海绵以调节miRNA 表达进而影响膀胱癌细胞的生物学行为。如lncRNA 肺腺癌转移相关转录本1（MALAT1）通过靶向miR-124 促进膀胱癌肿瘤的生长和转移。lncRNA 尿路上皮癌相关1（UCA1）通过与miR-196a-5p 作用参与调节膀胱癌细胞顺铂/吉西他滨耐药［16］。此外，LINC00689 调节miR-655、miR-496、miR-526b-3p 表达参与骨肉瘤、前列腺癌、胃癌进展［12-14］。因此，本研究假设LINC00689 在胃癌中也具有miRNA 海绵作用。进一步研究表明，荧光素酶报告基因LINC00689 直接靶向miR-876-5p，且抑制LINC00689 可增加miR-876-5p 表达，而过表达LINC00689 则抑制miR-876-5p 表达。已有研究证实，miR-876-5p 在结直肠癌中表达明显下调，过表达miR-876-5p 有效抑制结直肠癌细胞的增殖、集落形成和侵袭等恶性行为，抑制裸鼠移植瘤生长，在结直肠癌中发挥抗肿瘤作用［17］。miR-876-5p 通过抑制骨形态发生蛋白4（BMP-4）表达抑制肺癌细胞的体外迁移、侵袭、EMT 以及体内转移［18］。与上述研究类似，本研究显示膀胱癌组织、T24 细胞中miR-876-5p 表达显著降低，过表达miR-876-5p显著降低T24 细胞增殖活力、诱导细胞凋亡并相应影响相关蛋白表达。此外，miR-876-5p 表达抑制可抑制LINC00689 对T24 细胞的增殖抑制和凋亡促进作用，这说明LINC00689 通过靶向miR-876-5p 表达进而调控T24 细胞的增殖和凋亡。然而，LINC00689、miR-876-5p 在膀胱癌动物模型中的作用仍需进一步探讨。

总之，本研究证实膀胱癌中LINC00689 表达增加，抑制LINC00689 通过负调控miR-876-5p 进而抑制膀胱癌细胞T24 增殖、诱导细胞凋亡，进而抑制膀胱癌进展。LINC00689/miR-876-5p 分子轴的发现可能为膀胱癌患者治疗提供有效靶点。