褪黑素通过调控EZH2表达增强食管癌细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性

秦文兵 张月丽 刘嘉 李瑞佳 张锐

1西安市第八医院药剂科（西安710000）；2郑州市中心医院临床药学科（郑州450007）；3陕西省肿瘤医院重症医学科（西安710000）

在世界范围内，食管癌的发生率位列恶性肿瘤第八位，死亡率为第六位［1］。根治性手术是食管癌治疗的首选，但80%的食管癌患者在确诊时已失去手术的机会［2-3］。因此放疗或者化疗是中晚期食管癌患者维持治疗的主要方式［4］。5-氟尿嘧啶（5-FU）是食管癌临床化疗最常用的药物之一［5］。5-FU 的主要作用机理是通过不可逆性抑制胸苷酸，干扰DNA 的合成。5-FU 对正常细胞也会产生毒性，同时癌细胞对5-FU 容易产生抵抗性。因此，寻找其他药物试剂与5-FU 联合使用，提供更多有效的方法使癌细胞对化疗敏感，同时减少对正常细胞的毒性是非常必要的。

褪黑素（melatonin，MLT）是哺乳动物和人类松果体内产生的一种胺类激素。近年来，国内外的研究［6-8］发现褪黑激素具有促进睡眠、调节时差、抗衰老、调节免疫、抗肿瘤等多项生理功能。也有研究［9-11］表明褪黑素能够调节肿瘤细胞的增殖周期和凋亡等生物学功能。研究［12-14］已经证明褪黑素能够通过增加对肿瘤化疗药物的敏感性、降低耐药率提高药物的疗效，并且能够降低化疗药物的毒性。同时褪黑素与化疗药物联合使用能够提高化疗药物的疗效［15-16］。但是，目前在食管癌中褪黑素对5-FU 化疗敏感性的影响及相关作用机制的研究还很缺乏。

1 材料与方法

1.1 主要材料和试剂人食管癌细胞株EC-9706和EC-109 购自中国科学院上海细胞库。褪黑素和5-FU 购自美国Sigma 公司。胎牛血清、RPMI 1640培养基购于HyClone公司。一抗Bcl-2、Mcl-1、EZH2和二抗购于Abcam 公司。CCK-8 试剂盒、蛋白提取试剂盒、凋亡检测试剂盒和ECL 发光试剂盒均购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养及转染人食管癌细胞株EC-9706和EC-109细胞均培养于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL 链霉素的RPMI 1640 培养基中，于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。按照说明书，使用脂质体3000 进行pc-DNA 质粒的转染。

1.3 CCK-8 检测细胞活力取对数生长期的细胞，调整细胞密度为5 × 104/mL，96 孔板每孔接种量为100 μL，37 ℃孵育过夜。24 h 后，当细胞融合率达到70% ～80%时，加入含有不同药物的新鲜培养基，每个实验组设置3 个复孔，继续培养。药物作用24、48 和72 h 后，每孔加入10 μL 的CCK-8溶液，继续孵育2 h，于酶标仪450 nm 处检测细胞吸光度（OD）值。细胞活性（%）=（加药组平均OD值-空白对照组平均OD值）/（对照组平均OD值-空白对照组平均OD值）×100%。

1.4 Transwell 检测细胞侵袭迁移收集细胞，用不含血清的培养基重悬。Transwell 迁移试验中，将含有5 × 104个细胞的培养基直接接种于Transwell上室中。侵袭实验，前一天在Transwell 的上室中预铺基质胶（BD biosciences）。Transwell 下室中加入600 μL 含10%胎牛血清的培养基。37 ℃孵育24 h后，对已迁移或侵袭膜下表面的细胞用4%的多聚甲醛固定30 min，0.1%结晶紫（Sigma）染色20 min。在显微镜下观察5 个随机视野进行计数和成像。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡不同药物处理EC-9706 细胞24 h 后，收取细胞，PBS 洗涤，室温1 700 r/min离心5 min，弃上清，后加入400 μL Binding Buffer，重悬细胞；加入5 μL Annexin V-FITC，室温放置15 min，再加入10 μL PI，轻柔混匀后置于冰上避光5 min，之后使用流式细胞仪检测。

1.6 Western blot 检测收取细胞，提取蛋白并测定浓度。每孔上样量为30 μg，将样品进行凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳后将蛋白转至PVDF 膜上。5%脱脂牛奶室温封闭2 h，分别加入Bcl-2、Mcl-1、EZH2 一抗4 °C 孵育过夜，TBST 洗涤3 次，每次10 min；二抗室温孵育2 h，TBST 洗涤3 次，每次10 min；ECL 发光，Bio-Rad 成像仪成像。图像用Image J 1.48 软件对各蛋白条带进行灰度值定量分析，以GAPDH 蛋白表达为内参，分析各蛋白的相对表达水平。实验重复3 次。

1.7 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）Trizol 法（Invitrogen，USA）从细胞和组织中提取总RNA，逆转录试剂盒将总RNA 逆转录为cDNA，使用ABI 7500 实时荧光定量PCR 仪进行定量分析。实验重复3 次，应用2-△△ct法计算结果。

1.8 荷瘤实验将12只4 ～6周龄BALB/c雄性裸鼠［体质量约（20±2）g］随机分为两组：A组为5-FU组（20 mg/kg），B 组为褪黑素与5-FU 联合组（25 mg/kg+ 20 mg/kg）。用PBS 将EC-9706 细胞调整为1 ×107/mL 的浓度，在无菌的条件下，用1 mL 注射器皮下注射100 μL 细胞悬液于裸鼠右侧腋下。裸鼠接种后的第8 天开始给药处理，每两天给药1 次。从接种开始，每隔一天测量裸鼠体重、肿瘤体积。在第23 天处死裸鼠并剥离肿瘤组织、称重。

1.9 免疫组化用S-P 法进行免疫组织化学染色。加抗EZH2（1∶200 稀释）的一抗，4 ℃孵育过夜，PBS洗涤，加二抗（1∶2 000 稀释），显色并复染，设置对照。高倍显微镜下（×400）每张切片随机选取5 个不同的视野，测定光密度值并计算平均值。

1.10 统计学方法数据以均值±标准差表示。计量资料组间分析采用t检验，多组之间采用单因素方差分析。数据分析采用SPSS 19.0 软件（SPSS，Chicago，IL，USA），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 褪黑素增强5-FU 抑制食管癌细胞增殖的能力CCK-8 结果显示，褪黑素对EC-9706 和EC-109细胞活力的抑制呈剂量依赖性（P＜0.01，图1A、B）；同时，5-FU 对EC-9706 和EC-109 细胞活力的抑制也呈剂量依赖性。褪黑素和5-FU 联合处理组，与单独5-FU处理相比，褪黑素显著增强5-FU介导的对EC-9706 和EC-109 细胞活力抑制的能力（P＜0.01，图1C、D）。同时，与褪黑素联合治疗显著增加食管癌细胞对5-FU的敏感性，与单独5-FU处理组相比，其IC50值显著下降（P＜0.01，图1E）。

图1 褪黑素和5-FU 单独或联合对食管癌细胞活力的影响Fig.1 Effect of melatonin and 5-FU alone or combined on the cell viability in esophageal carcinoma cells

2.2 褪黑素联合5-FU在不同时间对食管癌细胞活力的影响根据褪黑素单独处理食管癌细胞对细胞活力影响的结果，选择1 mmol/L 的褪黑素进行接下来的实验；根据食管癌细胞中5-FU的IC50值，选择40 μmol/L 的5-FU 处理EC-9706 细胞，60 μmol/L的5-FU 处理EC-109 细胞。褪黑素和5-FU 联合处理组，与单独褪黑素和5-FU 处理组比较，对细胞活力的抑制明显增强（P＜0.05）。接着，分别在24、48、72 h 检测了褪黑素和5-FU 联合处理对细胞活力的影响。结果显示，褪黑素和5-FU 联合处理组，与单独褪黑素和5-FU 处理组比较，显著增加对细胞活性的抑制（P＜0.01），见图2。

2.3 褪黑素联合5-FU 对EC-9706 细胞侵袭迁移的影响Transwell 结果显示，与DMSO 处理组比较，褪黑素处理组细胞侵袭和迁移的数量明显减少（P＜0.01）。褪黑素和5-FU 联合处理组，与单独褪黑素和5-FU 处理组比较，细胞侵袭和迁移的数量也显著降低（P＜0.01），见图3。

2.4 褪黑素联合5-FU 对EC-9706 细胞凋亡的影响流式细胞计数结果显示，与DMSO 组比较，褪黑素处理组细胞的凋亡率显著增加（P＜0.01）。褪黑素和5-FU 联合处理组，与单独褪黑素和5-FU处理组比较，细胞的凋亡率也显著增加（P＜0.01，见图4A、B）。Western blot结果显示，与DMSO组比较，褪黑素处理组蛋白Bcl-2 和MCL-1 的表达也显著降低（P＜0.01）；褪黑素和5-FU 联合处理组，与单独褪黑素和5-FU 处理组比较，蛋白Bcl-2 和MCL-1的表达也显著降低（P＜0.01，图4C、D）。

2.5 褪黑素增强5-FU 对食管癌中EZH2 表达的抑制与DMSO 组比较，褪黑素处理组EZH2 的表达量显著降低（P＜0.01）；褪黑素和5-FU 联合处理组，与单独MLT 和5-FU 处理组比较，在mRNA和蛋白水平均能显著降低EZH2 的表达（P＜0.01，图5A、B）。过表达EZH2 的实验发现，与对照组比较，过表达EZH2 能够逆转褪黑素联合5-FU 对EC-9706 细胞活力、侵袭迁移和凋亡的影响（P＜0.01，图5C、D、E）。

2.6 褪黑素促进5-FU 对裸鼠食管癌移植瘤生长的抑制体内移植瘤结果显示，在移植瘤实验的第23 天，与单独5-FU 给药组比较，褪黑素和5-FU联合给药组显著增强对移植瘤生长的抑制，肿瘤的体积和重量均有所减少（P＜0.01，图6A、B）。免疫组化、qRT-PCR 和Western blot 结果均显示，与单独5-FU 给药组比较，褪黑素和5-FU 联合给药组中EZH2的表达显著降低（P＜0.01，图6C、D、E）。

3 讨论

图2 褪黑素联合5-FU 在不同时间对食管癌细胞活力的影响Fig.2 Effect of combination of melatonin and 5-FU on cell viability in esophageal carcinoma cellsat different time

图3 褪黑素联合5-FU 对EC-9706 细胞侵袭迁移的影响Fig.3 Effect of combination ofmelatonin and 5-FU on cell invasion and migration inEC-9706 cells

早期食管癌的临床症状不明显，难于被发现；以控制播散为目的的化疗在食管癌的治疗方法中占有重要的地位。虽然化疗药物的研发已取得巨大进展，但是在临床实践中，化疗药物耐药仍时常发生，并已成为食管癌治疗失败的重要原因之一［17］。5-FU作为食管癌治疗的一线化疗药物，也面临药物毒副作用和耐药的难题。近期研究［11-12，14］发现褪黑素在多种肿瘤中具有抗肿瘤的作用，包括胰腺癌、肝癌、乳腺癌、结直肠癌等。研究又发现褪黑素与化疗药物合用能够影响化疗药物的疗效。通过夜间光照诱导生理性褪黑素合成的紊乱，能够抑制肿瘤抑制基因ARHI 的表达并介导stat3 驱动的乳腺癌紫杉醇耐药［13］。也有研究［16］发现，褪黑素及其代谢物能够增强胰腺癌细胞对吉西他滨的化学敏感性。因此，在食管癌中，褪黑素与5-FU 合用能否提高5-FU 的化疗敏感性、降低细胞毒性是本次研究的目的。

有研究［18-19］表明褪黑素能够降低膀胱癌和结直肠癌的细胞活性并且在一定浓度范围内呈剂量依赖性。本研究也发现褪黑素能够降低食管癌细胞EC-9706 和EC-109 的活性并且呈剂量依赖性。刘玲玲等［20］的研究也发现，随着褪黑素浓度的逐渐提高，对EC-109 的抑制作用明显提高，这与本研究结果是一致的。同时，笔者发现联合褪黑素能够显著提高5-FU 对EC-9706 和EC-109 细胞活力的抑制。研究［19］表明，在结直肠癌细胞中褪黑素可增强5-FU 对肿瘤细胞生长的抑制。另外，联合褪黑素能够显著降低食管癌细胞对5-FU 的IC50值。以上结果表明，联合褪黑素能够增加食管癌细胞对5-FU 的敏感性。

图4 褪黑素联合5-FU 对EC-9706 细胞凋亡的影响Fig.4 Effect of combination ofmelatonin and 5-FU on cell apoptosis inEC-9706 cells

图5 褪黑素联合5-FU 对EC-9706 细胞中EZH2 表达的影响Fig.5 Effect of combination ofmelatonin and 5-FU on EZH2 expression in EC-9706 cells

本研究结果提示褪黑素和5-FU 对食管癌细胞的敏感性和毒性的影响与诱导细胞凋亡有关。Bcl-2 和Mcl-1 是重要的凋亡调控基因，Bcl-2 和Mcl-1 蛋白的表达能够抵抗肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤进展。本研究表明褪黑素能够显著提高5-FU 介导的抑制凋亡抵抗蛋白Bcl-2 和Mcl-1 的表达，并进一步促进食管癌细胞的凋亡。本研究还发现，褪黑素和5-FU 联合能够显著降低食管癌细胞的侵袭和迁移能力，这也为临床上褪黑素和5-FU 联合使用抑制食管癌的进展提供了进一步的理论支持。此外，荷瘤实验也证实联合褪黑素和5-FU 能够显著抑制食管肿瘤的生长。

图6 褪黑素协同5-FU 在体内抑制食管癌的生长Fig.6 Melatonin combined with 5-FU inhibited the growth of esophageal cancer in vivo

Zeste 基因增强子同源物2（enhancer of zeste homolog2，EZH2）是多梳蛋白抑制复合体2 的催化亚基，能够抑制相关靶基因的转录。近年来的研究［21-24］发现，EZH2 在多种肿瘤中高表达，并证实EZH2 在肿瘤的发生、发展和预后等方面发挥重要作用。研究也证明EZH2是一个很有潜力的治疗靶标［25-26］。本研究发现褪黑素和5-FU 联合处理食管癌细胞能够显著降低EZH2的表达，过表达EZH2 能够逆转褪黑素协同5-FU 对EC-9706 细胞特性的影响。体内实验进一步证实了褪黑素协同5-FU 通过降低EZH2 的表达抑制食管肿瘤的生长。

综上所述，褪黑素和5-FU 协同抑制EZH2 的表达、促进细胞凋亡，进而提高食管癌细胞对5-FU的敏感性。尽管褪黑素增强食管癌细胞对5-FU的敏感性的详细作用机制仍需进一步的研究，但是本研究为对5-FU 耐药的治疗提供了初步的理论依据，并为5-FU 的联合治疗提供了新思路。