Ac-SDKP抑制SPP1/TGF-β1信号拮抗实验性矽肺的机制

蔡文臣 张诗汇 魏中秋 靳馥宇 李雅倩 李田 徐洪 杨方

华北理工大学1公共卫生学院，2临床医学院，3基础医学院（河北唐山063210）

尘肺病是我国最严重的职业病，对其发生、发展机制与防治研究一直是职业病研究领域的难点和热点问题［1-3］。课题组前期通过高通量测序技术，筛选到一些与矽肺发生发展有关的mRNA，并发现分泌性磷蛋白1（secretory phosphoprotein，SPP1）在矽肺模型组的差异表达具有代表性。研究表明，SPP1 的高表达与器官纤维化进展关系密切，其可通过激活转化生长因子1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）信号促进成纤维细胞分化和Ⅰ型胶原（collagen type I，COL I）表达［4-6］，对SPP1 的阻断可能是治疗肺纤维化的潜在靶点［7-9］。课题组多年来一直研究N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酰（N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline，Ac-SDKP）的抗器官纤维化作用机制［10-12］，因此本研究拟通过体内外实验，观察SPP1 在矽肺纤维化中的作用模式以及Ac-SDKP 能否通过调节SPP1/TGF-β1 信号拮抗矽肺纤维化。为获得矽肺纤维化作用靶点提供一定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂动式染尘自动控制系统（天津开发区合普工贸有限公司）；小鼠单核巨噬细胞RAW264.7（中国科学院上海细胞库）；二氧化硅（silicon dioxide，SiO2）（美国Sigama 公司），Ac-SDKP（瑞士Bachem AG 公司），SPP1 重组蛋白（10352-H08H，北京Sino Biological 公司），COLⅠ（ab34710，美国Abcam 公司），SPP1（AF0227，美国Affinity 公司），巨噬细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）（DF7577，美国Affinity 公司）；转化生长因子Ⅰ型受体（TGF-β receptor typeⅠ，TGFβRⅠ）（A16983，美国ABclonal公司）；TGFβR Ⅱ（ARG59501，上海Arigo 公司）；Smad2/3（5678，美国Cell Signaling Technology公司）；磷酸化Smad2/3（phosphate Smad2/3，p-Smad2/3）（8828s，美国Cell Signaling Technology 公司）；α-微管蛋白（alpha tubulin antibody，α-Tubulin）（美国Affinity 公司）；PV6000 通用型两步法免疫组化试剂（北京中杉公司）；山羊抗兔、抗鼠二抗（美国KPL公司）；ECL 显色试剂盒（北京庄盟生物公司）；苏木精染色液（珠海贝索公司）。

1.2 动物实验SPF 级雄性Wistar 大鼠［（180 ±10）g，3 周龄］于华北理工大学医学实验中心洁净级动物房［SYXK（冀）2015-0038］饲养。采用HOPE-MED8050 动式染尘构建矽肺大鼠模型，其中对照组吸入纯净气，模型组吸入50 μg/m3SiO2，3 h/d，5 d/周［10-12］。实验分组为（n= 18）：（1）对照组：吸入纯净气16 周后，腹腔内埋入含有生理盐水的微量缓释胶囊；（2）染尘组：动式染尘至16 周后，腹腔内埋入含有生理盐水的微量缓释胶囊；（3）Ac-SDKP 治疗组：动式染尘至16 周后，在大鼠腹腔内埋入含有Ac-SDKP［800 μg/（kg·d）］的微量缓释胶囊，均于24 周处理动物。

1.3 细胞培养和处理小鼠巨噬细胞RAW264.7在37 ℃含5%CO2的培养箱中用Ham′s F-12K 营养培养基培养，实验分组为：（1）对照组：无血清培养基培养；（2）SiO2诱导组：无血清培养条件下，给予200 μg/mL 的SiO2培养基诱导24 h；（3）Ac-SDKP处理组：无血清培养条件下，先给予10-8mol/L Ac-SDKP 诱导1 h，再加入SiO2（200 μg/mL）/SPP1 重组蛋白（1 μg/mL）诱导24 h。（4）SPP1 重组蛋白诱导组：无血清培养条件下，给予1 μg/mL 的SPP1 重组蛋白诱导24 h；（5）LY364947 抑制剂组：无血清培养条件下，先给予LY364947 抑制剂（59 nmol/L）培养1 h，再加入1 μg/mL的SPP1重组蛋白诱导24 h。

1.4 免疫组织化学染色石蜡切片常规脱蜡至水，常规制备细胞爬片。切片经高压修复，3%的H2O2封闭内源性过氧化物酶室温孵育15 min。滴加兔抗SPP1（1∶100），4 ℃过夜；滴加羊抗兔/小鼠免疫球蛋白G（1∶500）37 ℃孵育30 min，免疫组织化学显色试剂盒显色，镜下控制，常规复染，脱水透明，中性树脂封片，显微镜扫描。

1.5 免疫印迹法提取肺组织和RAW264.7 细胞蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，取10 ～20 μg蛋白进行常规电泳和电转，一抗COL I（1∶800），MCP-1（1∶1 000），TGFβR I（1∶1 000），TGFβRII（1∶1 000），p-Smad2/3（1∶500），Smad2/3（1∶500）和SPP1（1∶1 000）在4 ℃孵育过夜，山羊抗兔或抗小鼠二抗（1：5 000）孵育30 min。使用ECL发光试剂于ECLTM蛋白检测系统检测信号，使用Image Pro Plus 6.0软件测量平均光密度。以目标蛋白与内参蛋白α-Tubulin 的比值作为蛋白的相对表达量。

1.6 统计学方法采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。数据以均数±标准差表示。多组间采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ac-SDKP 抑制矽肺大鼠中SPP1 的表达如图1 所示，IHC 结果显示，与对照组比较，矽肺模型组中有较大的矽结节形成，结节中可见SPP1 阳性表达细胞的分布。与矽肺模型组比较，Ac-SDKP处理组的病变程度明显减轻，SPP1 阳性表达减少。

图1 SPP1 在Ac-SDKP 处理的染尘大鼠肺组织中的分布与表达（×200）Fig.1 The distribution and expression of SPP1 in Ac-SDKP treated silicosis rats lung tissues（×200）

Western blot 结果显示（图2），与对照组比较，矽肺模型组中COL I、MCP-1、TGF-β1 和SPP1 蛋白表达均升高（P＜0.05）。与矽肺模型组比较，Ac-SDKP 处理组中COLⅠ、MCP-1、TGF-β1 和SPP1 蛋白表达明显降低（P＜0.05）。

2.2 Ac-SDKP 抑制SPP1 在巨噬细胞中的表达IHC 结果显示，与对照组比较，SiO2诱导组中可见SPP1 阳性表达，与SiO2诱导组比较，Ac-SDKP 处理组中SPP1 阳性表达减少。

Western blot 结果显示（图4、5），与对照组比较，SiO2诱导组中COL I、MCP-1、TGF-β1 和SPP1的蛋白表达上调（P＜0.05）；与SiO2诱导组比较，Ac-SDKP 处理组中COL I、MCP-1、TGF-β1 和SPP1表达降低（P＜0.05）。

2.3 Ac-SDKP抑制SPP1/TGF-β1信号通路如图6 所示，与对照组比较，SPP1 诱导组中TGFβRII、TGFβRI、p-Smad2/3 和SPP1 蛋白表达明显升高（P＜0.05），与SPP1诱导组比较，Ac-SDKP处理组和LY364947 处理组中TGFβRII、TGFβRI、p-Smad2/3和SPP1 蛋白表达降低（P＜0.05）。

3 讨论

图2 COL I、MCP-1、TGF-β1 和SPP1 蛋白在Ac-SDKP 处理的染尘大鼠肺组织中的表达（n=3）Fig.2 The expression of COL I，MCP-1，TGF-β1 and SPP1 in Ac-SDKP treated silicosis rats lung tissues（n=3）

图3 SPP1 在Ac-SDKP 处理的RAW264.7 细胞中的表达（×200）Fig.3 The expression of SPP1 in Ac-SDKP treated RAW264.7 cells（×200）

图4 COL I、MCP-1、TGF-β1 和SPP1 蛋白在Ac-SDKP 处理的RAW264.7 细胞中的表达（n=3）Fig.4 The expression of COL I，MCP-1，TGF-β1 and SPP1 in Ac-SDKP treated RAW264.7 cells（n=3）

图5 TGF-β1 和SPP1 蛋白在Ac-SDKP 处理的RAW264.7细胞培养基中的表达（n=3）Fig.5 The expression of TGF-β1 and SPP1 in Ac-SDKP treated RAW264.7 cells medium（n=3）

图6 TGFβRII、TGFβRI、p-Smad2/3 和SPP1 在Ac-SDKP、LY364947 处理的给予SPP1 重组蛋白的巨噬细胞中的表达（n=3）Fig.6 The expression of TGFβRII，TGFβRI，p-Smad2/3，SPP1 in Ac-SDKP and LY364947 treated RAW264.7 cells with SPP1 recombinant protein（n=3）

课题组前期利用动式染尘大鼠模型进行了转录组测序分析，发现了一些与矽肺纤维化进展有关的mRNA 与非编码RNA［12］，综合差异变化倍数和丰度，发现SPP1 基因表达差异在实验性矽肺模型中具有代表性。SPP1 与心血管疾病、肿瘤、糖尿病、肾病关系密切，具有多种生物学功能，主要参与调控炎症，介导骨代谢和损伤修复，在调控巨噬细胞、T 细胞、破骨细胞功能等方面发挥了重要作用［13］。近年来发现，SPP1 在博来霉素介导的肺间质纤维化模型［7-8］、石棉肺小鼠模型［14］、辐照所致的肺间质纤维化模型［15］中表达均上调，提示SPP1在肺纤维化进展中可能起到了一定的调节作用。本研究结果显示，在动式染尘矽肺大鼠模型以及体外SiO2诱导的RAW264.7 细胞中，SPP1 均显著上调，IHC 结果也显示，SPP1 主要表达于矽肺结节内，且SiO2诱导后RAW264.7 细胞中SPP1 阳性染色明显增强，提示SPP1 可能参与了矽肺纤维化的进展。

在体外培养的来源于肝、皮肤和肺的成纤维细胞中，均发现SPP1能够激活TGF-β1信号，从而促进了肌成纤维细胞分化，加速了纤维化进程；SPP1 能够通过上调基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases 9，MMP9）的表达，进而激活TGF-β1，从而促小鼠成纤维细胞的胶原沉积［4-6，17-19］。本研究也发现，在实验性矽肺模型中，SPP1/TGF-β1 信号的激活伴随着胶原沉积和巨噬细胞活化。已有研究显示，采用单细胞RNA 测序发现，特发性肺纤维化中巨噬细胞亚群高表达SPP1［19］，且在纤维化过程中随着炎症和纤维化程度的加深，SPP1 的表达逐渐升高［7］，说明SPP1 可调节巨噬细胞极化并产生大量炎症介质和细胞因子［9，20］。在本研究中，予以SiO2诱导RAW264.7 细胞，细胞内和培养基中均检测到SPP1/TGF-β1 表达的增高；进一步采用SPP1重组蛋白诱导，可发现TGF-β1 信号的活化，予以TGF-β1 信号通路抑制剂则引起相反变化，提示SiO2能够刺激巨噬细胞分泌SPP1，进而活化TGFβ1 信号，参与了肺纤维化进展。

课题组对Ac-SDKP 的抗矽肺纤维化作用进行了系列研究［21-23］，发现其能够通过抑制巨噬细胞活化和肌成纤维细胞分化，保护肺泡Ⅱ型上皮细胞从而拮抗矽肺纤维化进展。本研究中，体内外实验均提示，予以Ac-SDKP 能够抑制矽肺大鼠和体外RAW264.7 细胞中SPP1 表达水平的上调，并具有类似TGF-β1 信号通路抑制剂的作用，能够阻断SPP 对TGF-β1 信号的激活作用。

综上所述，本研究发现Ac-SDKP 通过对SPP1/TGF-β1 信号的阻断，抑制了巨噬细胞的活化，然而其具体作用机制，仍需进一步研究探讨。