原肌球蛋白3在雄性ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化组织中的表达

（中国医科大学附属盛京医院第二内分泌科，沈阳 110004）

原肌球蛋白（tropomyosins，TPM）是微丝的重要组成部分，参与调节肌动蛋白细胞骨架，主要参与骨骼肌和平滑肌细胞的收缩或维持非肌细胞中细胞骨架的稳定性［1］。TPM呈卷曲螺旋二聚体，沿着肌动蛋白丝形成头对尾聚合物。目前，TPM中4种哺乳动物基因已确认，分别命名为TPM1、TPM2、TPM3和TPM4。因启动子的多变性和外显子的剪切，这4种基因至少可表达出40多种亚型［2］。这些亚型在分布和结构上具有组织和肌丝特异性，与细胞形态和功能转化有密切联系，并且还调节其他蛋白质（肌动蛋白解聚因子/共纤维蛋白和肌球蛋白）与肌动蛋白相互作用［3］。

TPM3是一种肌动蛋白结合蛋白，存在于骨骼肌、平滑肌和一些非肌肉组织中。骨骼肌中TPM3介导肌球蛋白-肌动蛋白对钙离子的反应，并参与细胞骨架微丝的稳定［4］。有研究［5］报道癌症发展伴随着肿瘤细胞对TPM3依赖增加；胶质瘤中表达较高水平的TPM3往往预后极差。肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞系中扩增TPM3导致上皮间质转化上调和上皮钙黏蛋白下调，而上皮钙黏蛋白下调最终导致HCC迁移和入侵以及更差的预后［6］。细胞骨架是真核细胞中维持细胞形态结构和细胞运动有关的纤维网络，它决定细胞形态，由微丝、微管和中间丝组成。细胞迁移是生物体的重要生命过程，需要细胞骨架参与，尤其是由肌动蛋白组成的微丝骨架的参与。肌球蛋白收缩、肌动蛋白聚合、细胞黏附都会影响细胞的迁移［7］。TPM3通过稳定肌动蛋白丝结构构建细胞骨架，参与细胞运动［8-10］。

本课题组前期通过从单核细胞cDNA文库中筛选出与雄激素受体相互作用的TPM3蛋白，并证实了二者在体外存在相互作用［11］。本研究建立脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E gene knockout，ApoE-/-）雄性小鼠动脉粥样硬化模型，探讨TPM3在动脉粥样硬化组织内表达情况，旨在为男性动脉粥样硬化防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立及分组

6周龄ApoE-/-雄性小鼠（ApoE-/-组）和C57BL/6J雄性小鼠（C57BL/6J组）购自辽宁长生生物公司，每组6只，体质量20～25 g，生长状态发育良好，于中国医科大学研发中心动物部SPF级实验室（室内温度20～26 ℃，日温差≤4 ℃，相对湿度40%～70%）高脂饲料（蛋白质20%、脂肪35%、糖类45%，购自Research Diets公司）喂养，自由饮水，15周后处死。

1.2 主要试剂及仪器

小鼠TPM3单克隆抗体（ab113692，美国Abcam公司），通用SP试剂盒、DAB显色试剂盒（中杉金桥公司），柠檬酸钠抗原修复液（C1031，中国Solarbio公司），PBS磷酸盐缓冲液（P1010，中国Solarbio公司），高脂饲料（D12336，美国Research diets公司）。

1.3 方法

1.3.1 动脉粥样硬化标本制备：取高脂饮食喂养后的雄性ApoE-/-小鼠和C57BL/6J小鼠主动脉降段血管，将标本置入4%中性甲醛固定液中固定24 h。取出组织并切割合适大小后放入对应脱水盒，做好标记，室温下依次经过75%乙醇4 h、85%乙醇2 h、95%乙醇2 h、95%乙醇Ⅰ中2 h、95%乙醇Ⅱ中2 h、100%乙醇Ⅰ中20 min、100%乙醇Ⅱ中30 min、100%乙醇Ⅲ中30 min脱水。然后将脱水盒置二甲苯Ⅰ中15 min，后置入二甲苯Ⅱ中10 min，后放入二甲苯Ⅲ中10 min。然后入石蜡Ⅰ（熔点56 ℃）1 h、石蜡Ⅱ（熔点58 ℃）1.5 h浸蜡、包埋。修块后4 ℃保存。

1.3.2 HE染色：（1）脱蜡水化，切片依次入二甲苯Ⅰ中5 min、二甲苯Ⅱ中5 min、二甲苯Ⅲ中5 min，再放入100%乙醇中5 min、95%乙醇中5 min、80%乙醇中5 min、70%乙醇中5 min后下行至双蒸水10 min。（2）苏木素染色，入苏木素稀释液20 min，自来水冲洗，入0.5%盐酸分色数秒钟。（3）伊红染色：入蒸馏水中20 min、伊红染液中染色2 min、95%乙醇分色。（4）透明封片，依次入100%乙醇Ⅰ中5 min、100%乙醇Ⅱ中5 min、二甲苯Ⅰ中5 min、二甲苯Ⅱ中5 min、用中性树胶封片，标记备用。（5）动脉内膜厚度测量，切片在显微镜下仔细观察并采集放大100倍时的图像，在圆形动脉0时、1时30分、3时、4时30分、6时、7时30分、9时、10时30分时钟方向的8个点上用ImagePro Plus 6.0软件测量内膜的厚度。然后计算内膜厚度平均值。

1.3.3 免疫组化染色：将切片依次入二甲苯Ⅰ中15 min、二甲苯Ⅱ中10 min、二甲苯Ⅲ中5 min、100%乙醇中10 min、100%乙醇中10 min、95%乙醇中10 min、90%乙醇中10 min、85%乙醇中10 min、75%乙醇中10 min，下行至PBS中5 min。将脱蜡后的切片入柠檬酸钠修复液微波修复15 min，自然冷却至常温，然后PBS溶液清洗。滴加100 μL内源性过氧化物酶阻断剂，37 ℃孵育20 min，后用PBS溶液清洗。滴加100 μL封闭用山羊血清，37 ℃孵育20 min。滴加100 μL一抗工作液 4 ℃过夜。滴加100 μL生物素标记的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育20 min，然后PBS溶液清洗。滴加100 μL辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育20 min然后PBS溶液清洗。滴加100 μL DAB显色剂工作液，光镜下出现棕黄色颗粒后终止显色反应。流动自来水充分冲洗5 min，苏木素染液复染20 s。切片依次入75%乙醇中5 min、85%乙醇中5 min、90%乙醇中5 min、95%乙醇中5 min、100%乙醇中5 min、100%乙醇中5 min、二甲苯Ⅰ中5 min、二甲苯Ⅱ中10 min脱水透明。使用中性树胶封片。显微镜下仔细观察切片并采集放大100倍时图像，TPM3阳性表达为细胞内棕褐色或棕黄色、淡黄色颗粒。ImagePro Plus 6.0软件测量斑块内阳性细胞积分光密度（integral optical density，IOD）值及面积，计算平均IOD值。

1.4 统计学分析

采用Image-Pro Plus 6.0软件统计动脉斑块厚度及IOD，数据以表示，2组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果

结果显示，ApoE-/-组雄性小鼠动脉内皮细胞脱落，可见向腔内凸起的斑块，内膜明显增厚，中膜钙化增生、平滑肌纤维排列紊乱，内膜下平滑肌细胞可见增生、坏死，粥样硬化斑块非常明显，并有泡沫细胞积聚。提示造模成功。C57BL/6J组雄性小鼠动脉内膜光滑未见斑块形成，见图1。ApoE-/-组小鼠动脉内膜厚度（46.375±17.898）μm，C57BL/6J组小鼠动脉内膜厚度为（0.629±0.114）μm，2组比较差异有统计学意义（P＜ 0.05）。

图1 2组小鼠动脉组织HE染色结果×100

2.2 免疫组化染色结果

结果显示，ApoE-/-组动脉粥样硬化斑块内TPM3表达显著。TPM3阳性表达为胞质或胞膜内的棕黄色颗粒，主要分布在内皮细胞和含有泡沫细胞和平滑肌细胞等成分的斑块组织内部。C57BL/6J组雄性小鼠动脉经过免疫组化染色后，观察到动脉内膜内未见明显 TPM3 蛋白表达，见图2。动脉斑块TPM3表达ApoE-/-组为0.099 6±0.020 7，C57BL/6J组为0.005 6±0.002 5，2组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。

图2 2组小鼠动脉组织免疫组化染色结果×100

3 讨论

目前，心血管疾病仍是全球死亡的主要原因，每年有数百万人因心血管疾病死亡。心血管疾病发生的主要原因是动脉粥样硬化，而动脉粥样硬化是一种逐渐发展的慢性炎症性疾病，最终可导致严重的临床表现（心肌梗死或中风）［12］。已有研究显示，动脉粥样硬化形成发展涉及内皮细胞［13］、血管平滑肌细胞［14］、巨噬细胞［15］、血小板和细胞因子［16］等，但发病机制尚未明确。

性别差异与动脉粥样硬化的关系受到越来越多的关注。研究［17］显示男性动脉粥样硬化发生率高于女性；雄激素是男性体内重要激素，临床上以睾酮水平反应雄激素水平，睾酮水平降低时男性动脉粥样硬化发病率升高。雄激素依赖雄激素受体发挥作用；雄激素相关受体分布广泛，心房、心室肌纤维，血管内皮细胞和平滑肌细胞均有表达。睾酮通过诱导一氧化氮生成释放影响内皮细胞功能，从而影响血管张力及斑块形成［18］。也有研究［19-20］显示睾酮也可能对凝血和纤溶系统、血管平滑肌细胞、单核巨噬细胞等产生作用来影响动脉粥样硬化的发生发展。

本研究免疫组化结果显示，TPM3阳性表达主要分布在斑块的纤维帽。纤维帽内包括内皮细胞、巨噬细胞和平滑肌细胞等。TPM3作为关键的细胞骨架蛋白在雄性小鼠动脉粥样硬化形成过程中表达，可能参与细胞迁移，从而促进动脉粥样硬化的形成。有研究［21-23］表明，TPM3在胰腺癌、乳腺癌和食管癌中高表达，可能与癌细胞的转移有关，其表达升高与不良预后相关。TPM3作为细胞骨架的组成成分是否参与动脉粥样硬化的形成过程国内外均未见报道。本研究显示雄性ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化组织内TPM3高表达，表明TPM3可能作为骨架蛋白参与细胞迁移，影响动脉粥样硬化的形成过程。

综上所述，雄性ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化组织内存在TPM3蛋白表达，雄激素可能通过与TPM3蛋白相互作用影响细胞迁移来参与动脉粥样硬化形成，但具体机制尚不明确，需要进一步研究论证。