基于正常大鼠物质能量代谢状况探讨怀菊花的寒热药性

2021-02-03米汪洋杨翠兰克迎迎王梦梦单增福李亚格冯卫生郑晓珂

中草药 2021年3期

米汪洋，杨翠兰,，克迎迎，王梦梦，单增福，李亚格，冯卫生，郑晓珂*

1.河南中医药大学，河南郑州 450008

2.柘城县人民医院，河南商丘 476200

中药药性理论的主要内容有四气（性）、五味、升降浮沉、归经、毒性等。四气又称四性，即寒、热、温、凉，都是古人从药物作用于机体所发生的反应而做出的概括性归纳。中药的寒热药性反映了药物对人体阴阳盛衰、寒热变化的作用倾向[1-2]，是中药药性理论的核心及指导中医临床用药的主要依据[3]。

匡海学教授提出，促进机体能量、物质代谢的中药多具有热（或温）性，抑制机体能量、物质代谢的中药多具有寒（或凉）性[4]。药性（气）的现代研究可以通过宏观的正常或寒、热动物模型实验以及系统生物学等方法予以评价归属[5]。本实验室前期研究[6-7]发现寒凉药桑白皮能抑制正常大鼠的物质、能量代谢，改善热症模型大鼠物质、能量代谢的高水平亢奋状态。有研究发现激活腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase ， AMPK ） / 雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信号通路，能够促进能量代谢，增强细胞活性[8]。王仁和[9]发现益糖康改善糖尿病心肌病大鼠的糖脂代谢紊乱异常可能是通过促进大鼠心肌细胞AMPK 蛋白的表达实现的。蒲鹏[10]发现野黄芩苷可以抑制高糖诱导的野生型肝细胞炎症通路，这一效应是依赖AMPKα2 的激活而实现的。现代研究认为AMPK是机体维持各种代谢平衡所必需的，是葡萄糖水平和能量代谢的感受器[11]。

怀菊花为菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥头状花序，气清香，味甘、苦，性微寒，归肺、肝经，具有平肝明目、散风清热、清热解毒的功效[12-13]。现代药理研究表明，菊花具有抗炎[14]、降血糖[15]、保护心血管[16]、抗抑郁[17]等药理作用。本研究选择黄柏、黄连、黄芩3味典型寒性中药和干姜、花椒、肉桂3 味典型热性中药，通过分析典型寒、热中药对正常大鼠糖原合成酶（glycogen synthase，GS）、磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（ phosphoenolpyruvate carboxykinase ，PEPCK）、己糖激酶（hexokinase，HK）、磷酸果糖激酶1（phosphofructokinase-1，PFK-1）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）、糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，PYGL）、异柠檬酸脱氢酶（isocitrate dehydrogenase，ICD）、丙酮酸脱氢酶复合物（pyruvate dehydrogenase complex，PDHC）、乙酰辅酶A 羟化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）、丙二酰辅酶 A（malonyl-CoA）、激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL）、甘油激酶（glycerokinase，GK）、3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A 还原酶（3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase，HMGR）、谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）、解偶联蛋白（uncoupled protein，UCPs）、细胞色素C 还原酶（cytochrome C reductase，CCR）、细胞色素C 氧化酶（cytochrome C oxidase，COX）、腺苷酸激酶（adenosine kinase，ADK）、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）、ATP 合酶（adenosine triphosphate synthase，ATPs）以及AMPK 信号通路关键蛋白的影响，建立寒、热中药对正常大鼠物质能量代谢情况的评价系统，进而探讨怀菊花的“微寒”药性，为中药药性的评价提供研究方法。

1 材料

1.1 动物

由北京维通利华实验技术有限公司提供的SPF级SD 雄性大鼠64 只，8 周龄，体质量（200±20）g，动物许可证号：SCXK（京）20160006。喂养在18～25 ℃,湿度40%～60%、黑暗/光亮周期为12 h的清洁级动物实验室内，适应性喂养5 d 后用于实验。所有动物实验均得到河南中医药大学机构动物护理和研究伦理委员会的批准（批准号DWLL201903061）。

1.2 药物

黄柏（批号140301）、黄连（批号140702）、黄芩（批号1407103）、花椒（批号140601）、干姜（批号140702）购于张仲景大药房，肉桂（批号140502）、怀菊花（批号140502）购于河南省顺康医药有限责任公司，由河南中医药大学董诚明教授鉴定黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendron chinenseSchneid.的干燥树皮，黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch.的干燥根茎，黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensisGeorgi 的干燥根，干姜为姜科植物姜Zingiber offcinaleRoscoe 的干燥根茎，花椒为芸香科植物花椒Zanthoxylum bungeanumMaxim.的干燥成熟果皮，肉桂为樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl.的干燥树皮，怀菊花为菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥头状花序。

1.3 试剂与仪器

GS、PEPCK、HK、PFK-1、PK、PYGL、ICD、PDHC、ACC、malonyl-CoA、HSL、GK、HMGR、GDH、UCPs、CCR、COX、ADK、ATPs、ATP（苏州卡尔文生物科技有限公司，批号E20180101A）；BCA 试剂盒（北京索莱宝生物科技有限公司，批号20170815）；AMPK（武汉三鹰生物技术有限公司，批号 18167-1-AP）；p-AMPK（Cell Signaling Technology 公司，批号#5562）；β-actin、荧光兔源非特异性抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，批号分别为AC026、AS003）。

Odyssey®CLX 近红外荧光成像仪（美国LI-COR 公司）；通用电泳仪、Trans-Blot®Plus 转印槽（美国BIO-RAD）；Multiskan MK3 酶标仪、自动洗板机（美国Thermo 公司）；Mills-Q 超纯水仪（苏州赛恩斯仪器有限公司）；DZF-6050B 真空干燥箱（北京恒泰丰科试验设备有限公司）；十万分之一精密分析天平（德国 Sartorius 公司）；BCD-206TAS 低温冰箱（海尔公司）；YLS-IB 多功能大鼠自主活动记录仪（济南益延科技发展有限公司）；5810R 高速冷冻离心机、移液器（德国Eppendorf 公司）；SK-1 快速混匀器（常州国宇仪器制造有限公司）；BT25S 37 ℃恒温箱（上海-恒科技有限公司）；WD-9405B 型水平摇床（北京市六一仪器厂）；医用电子体温计（东阿阿胶阿华医疗器械有限公司）；常规手术器械。

2 方法

2.1 药物的制备

称取足够量的各药材饮片，10 倍量的水浸泡60 min 后开火煎煮60 min，多层纱布滤过，药渣再加入10 倍量水，煎煮60 min，多层纱布滤过，合并2 次药液，浓缩后冷冻干燥得到水煎提取物，各药材的提取率分别为黄柏16.4%、黄连25%、黄芩50%、花椒13.0%、干姜15.14%、肉桂8.17%、怀菊花28.0%，给药前用蒸馏水稀释至所需浓度，4 ℃储存备用。

2.2 动物分组及给药

动物适应性喂养后，按照体质量均衡原则分为对照组、黄柏组、黄连组、黄芩组、花椒组、干姜组、肉桂组以及怀菊花组。每天上午9:00 给药，对照组给予矿泉水，黄柏组ig 8.4 g/kg 黄柏水煎提取物，黄连组ig 3.5 g/kg 黄连水煎提取物，黄芩组ig 7.0 g/kg 黄芩水煎提取物，花椒组ig 4.2 g/kg 花椒水煎提取物，干姜组ig 7.0 g/kg 干姜水煎提取物，肉桂组ig 3.5 g/kg 肉桂水煎提取物，怀菊花组ig 7.0 g/kg 怀菊花水煎提取物（按照人临床用量以体表面积折算为大鼠等效剂量的42 倍量给药[6]），不间断给药9 d 后，水合氯醛麻醉处死动物，取大鼠肝脏于液氮中快速冷冻之后转移至-80 ℃冰箱中备用。

2.3 大鼠体质量、肛温、自主活动次数的检测

每天检测各组大鼠的体质量及肛温，末次给药后检测大鼠体质量、肛温以及5 min 内的自主活动次数。

2.4 糖代谢相关酶GS、PEPCK、HK、PFK-1、PK、PYGL、ICD、PDHC 的检测

取各组大鼠肝脏制备组织匀浆，4 ℃、3500 r/min 离心10 min 后，取上清液依照试剂盒说明书检测GS、PEPCK、HK、PFK-1、PK、PYGL、ICD、PDHC 酶的水平。

2.5 蛋白质代谢相关酶ACC、malonyl-CoA、HSL、GK 的检测

取各组大鼠肝脏制备组织匀浆，4 ℃、3500 r/min 离心10 min 后，取上清液依照试剂盒说明书检测ACC、malonyl-CoA、HSL、GK 酶的水平。

2.6 脂代谢相关酶HMGR、GDH、UCPs 的检测

取各组大鼠肝脏制备组织匀浆，4 ℃、3500 r/min 离心10 min 后，取上清液依照试剂盒说明书检测HMGR、GDH、UCPs 酶的水平。

2.7 能量代谢相关酶CCR、COX、ADK、ATPs及ATP 含量的检测

取各组大鼠肝脏制备组织匀浆，4 ℃、3500 r/min离心10 min 后，取上清液依照试剂盒说明书检测CCR、COX、ADK、ATPs 酶的水平及ATP 的含量。

2.8 Werstern blotting 法检测AMPK 信号通路关键蛋白AMPKα、p-AMPKα 的表达

取对照组、黄芩组、干姜组、怀菊花组大鼠肝脏，依照组织总蛋白提取试剂盒说明书操作，提取各组肝脏总蛋白，用BCA 蛋白定量试剂盒测定总蛋白浓度，以每泳道60 μg 蛋白上样，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转膜至PVDF 膜上，用5%的脱脂奶粉封闭2 h，再分别加入p-AMPKα（1∶1000）、AMPKα（1∶1000）、β-actin（1∶2000）的一抗，室温孵育30 min 后4 ℃过夜孵育，用PBST 洗涤6 次，每次5 min，加入荧光二抗（1∶20 000）避光孵育1 h 后，避光用PBST 洗膜3 次，再用PBS 洗膜5 min。最后用Odyssey® CLX 近红外荧光成像仪显影。

2.9 统计分析

实验数据采用x±s表示，SPSS 18.0 进行组间单因素方差分析（One-Way ANOVA）。P＜0.05 表示具有显著性差异，P＜0.01 表示具有极显著性差异。通过MeV 软件绘制各检测指标处理结果的热度图。

3 结果

3.1 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠一般状况的影响

如表1 所示，各药物对大鼠体质量无影响；与对照组相比，典型寒性中药均能显著降低大鼠肛温、自主活动次数（P＜0.05、0.01），典型热性中药能够显著升高大鼠肛温及自主活动次数（P＜0.05、0.01）；怀菊花与典型寒性中药作用相似，能够显著降低正常大鼠的肛温（P＜0.05）。

表1 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠体质量、肛温、自主活动次数的影响 (±s,n=8)Table 1 Effects of Chrysanthemi Flos and typical cold-heat traditional Chinese medicine on body weight,anal temperature and times of voluntary activity in normal rats(±s,n=8)

与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs control group

组别剂量/(g·kg-1) 体质量/g 肛温/℃ 自主活动/(次·5 min-1)对照 — 273.30±25.68 36.73±0.37 128.90±15.07黄柏 8.4 283.22±14.45 36.40±0.09* 114.44±7.20**黄连 3.5 276.00±14.56 36.40±0.18* 115.20±14.41**黄芩 7.0 287.71±9.23 36.33±0.22* 116.90±7.17*花椒 4.2 274.20±8.85 37.43±0.23** 140.00±8.23*干姜 7.0 277.40±14.46 37.13±0.16* 146.90±7.17**肉桂 3.5 278.20±21.35 37.32±0.33** 137.10±13.76怀菊花 7.0 273.20±11.62 36.33±0.19* 119.70±12.54

3.2 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠 GS、PEPCK、HK、PFK-1、PK、PYGL、ICD、PDHC水平的影响

如表2、3 所示，与对照组相比，寒性中药能显著降低PEPCK、HK、PFK-1、PK、PYGL、ICD、PDHC 的水平（P＜0.05、0.01），热性中药能显著升高PEPCK、HK、PFK-1、PK、PYGL、ICD、PDHC的水平（P＜0.05、0.01）；怀菊花则与寒性中药作用相似，能显著降低PEPCK、HK、PFK-1、PYGL的水平（P＜0.05、0.01）。

3.3 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠ACC、malonyl-COA、HSL、GK 水平的影响

如表4 所示，与对照组相比，寒性中药可显著升高malonyl-COA 的水平（P＜0.05、0.01），降低HSL、GK 的水平（P＜0.05、0.01）；热性中药可显著降低ACC、malonyl-COA 的水平（P＜0.05、0.01）、升高HSL、GK 的水平（P＜0.05、0.01）；怀菊花则与寒性中药作用相似，极显著降低GK 的水平（P＜0.01）。

3.4 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠HMGR、GDH、UCPs 水平的影响

如表5 所示，与对照组相比，寒性中药能显著降低HMGR、GDH、UCPs 的水平（P＜0.05、0.01），热性中药能显著升高HMGR、GDH、UCPs 的水平（P＜0.05、0.01）；怀菊花则与寒性中药作用相似，能极显著降低GDH 的水平（P＜0.01）。

表2 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠GS、PEPCK、HK、PFK-1 水平的影响 (±s,n=8)Table 2 Effects of Chrysanthemi Flos and typical cold-heat traditional Chinese medicine on GS,PEPCK,HK and PFK-1 levels in normal rats (±s,n=8)

与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同*P ＜ 0.05 **P ＜ 0.01 vs control group,same as below

组别剂量/(g·kg-1) GS/(U·L-1) PEPCK/(IU·L-1) HK/(mU·L-1) PFK-1/(U·L-1)对照 — 730.95±95.33 41.68±6.56 708.05±33.19 1 444.15±204.53黄柏 8.4 863.65±261.97 31.11±1.94** 593.99±98.38* 1 236.91±194.35黄连 3.5 831.02±176.57 29.19±4.18** 600.03±58.18* 1 146.24±296.23*黄芩 7.0 930.04±207.26 33.27±4.22* 588.26±105.72** 1 059.28±80.26**花椒 4.2 662.69±184.60 53.05±8.8** 807.03±90.18* 1 507.06±236.73干姜 7.0 652.47±176.87 54.00±5.13** 837.20±78.68** 1 700.42±271.43*肉桂 3.5 629.78±194.75 50.82±8.59** 832.37±46.04** 1 666.19±170.91怀菊花 7.0 844.39±238.10 31.23±3.59** 600.97±69.72* 1 102.36±167.42**

表3 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠PK、PYGL、ICD、PDHC 水平的影响 (±s,n=8)Table 3 Effects of Chrysanthemi Flos and typical cold-heat traditional Chinese medicine on PK,PYGL,ICD and PDHC levels in normal rats (±s,n=8)

组别剂量/(g·kg-1) ICD/(U·L-1) PDHC/(IU·L-1) PK/(mU·L-1) PYGL/(U·L-1)对照 — 410.11±37.82 10.10±2.031 432.55±161.61 483.81±93.99黄柏 8.4 328.43±83.50 7.34±1.93 281.56±73.71* 414.18±65.95黄连 3.5 279.22±78.26** 6.97±1.63* 273.23±61.6** 368.81±75.27*黄芩 7.0 319.79±72.67* 7.31±1.86* 271.95±74.12** 348.80±58.33**花椒 4.2 498.72±100.36* 13.15±2.31* 564.63±50.23* 576.67±46.29*干姜 7.0 508.67±79.38* 14.21±2.70** 605.02±95.69** 592.96±104.85*肉桂 3.5 462.20±58.10 13.03±3.89* 568.48±83.19* 531.83±86.62怀菊花 7.0 323.10±71.93 7.47±1.87 329.42±132.03 398.09±54.39*

表4 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠ACC、malonyl-COA、HSL、GK 水平的影响 (±s,n=8)Table 4 Effects of Chrysanthemi Flos and typical cold-heat traditional Chinese medicine on levels of ACC,malonyl-CoA,HSL and GK in normal rats (±s,n=8)

3.5 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠CCR、COX、ADK、ATPs 及ATP 含量的影响

如表6 所示，与对照组相比，寒性中药能显著降低CCR、COX、ADK、ATPs 的水平（P＜0.05、0.01），热性中药能显著升高CCR、COX、ADK、ATPs的水平（P＜0.05、0.01）；怀菊花与寒性中药组作用相似，能显著降低CCR、ADK 的水平（P＜0.05、0.01）。

3.6 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠AMPK 信号通路的影响

如表7 和图1 所示，与对照组比较，黄芩显著降低p-AMPKα 蛋白的表达（P＜0.05），干姜显著升高p-AMPKα 蛋白的表达（P＜0.01），怀菊花与寒性中药黄芩作用相似，显著降低p-AMPKα 蛋白的表达（P＜0.01）。

3.7 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠物质能量代谢热图聚类分析

如图2 所示，以怀菊花及典型寒热中药检测的物质能量代谢相关指标为变量，采用Mev 聚类分析软件分析。结果发现，黄柏、黄连、黄芩3 味典型寒性中药聚为一类，干姜、花椒、肉桂3 味典型热性中药聚为一类，怀菊花和典型寒性中药的物质能量代谢指标趋势相似，与其聚为一类。

表5 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠HMGR、GDH、UCPs 代谢相关酶的影响 (±s,n=8)Table 5 Effects of Chrysanthemi Flos and typical cold-heat traditional Chinese medicine on metabolic enzymes related to HMGR,GDH and UCPs in normal rats (±s,n=8)

组别剂量/(g·kg-1)HMGR/(U·L-1) GDH/(U·L-1) UCPs/(ng·mL-1)对照 — 105.32±14.61 8.11±0.95 8.62±2.54黄柏 8.4 95.39±23.45 6.43±1.01** 6.49±1.29黄连 3.5 79.81±15.43* 5.96±1.25** 5.81±1.81*黄芩 7.0 78.24±6.69* 6.03±0.91** 6.69±1.98花椒 4.2 137.20±26.18** 9.11±0.98 12.17±2.44**干姜 7.0 143.40±22.74** 9.77±0.80* 12.38±2.41**肉桂 3.5 127.49±27.34** 9.52±2.19* 11.37±2.18*怀菊花 7.0 84.77±8.41 6.31±0.69** 6.11±1.73

表6 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠CCR、COX、ADK、ATPs 及ATP 含量的影响 (±s,n=8)Table 6 Effects of Chrysanthemi Flos and typical cold-heat traditional Chinese medicine on contents of CCR,COX,ADK,ATPs and ATP in normal rats (±s,n=8)

组别剂量/(g·kg-1) CCR/(U·L-1) COX/(U·L-1) ADK/(U·L-1) ATPs/(U·L-1) ATP/(nmol·L-1)对照 — 17.63±1.34 4.12±0.44 159.72±33.33 115.67±8.88 7 543.22±316.99黄柏 8.4 13.85±1.26** 3.13±0.56* 101.53±16.88** 91.73±12.46* 7 320.45±873.30黄连 3.5 13.93±2.63** 2.88±0.85** 93.40±17.62** 87.03±11.97* 7 673.62±656.44黄芩 7.0 14.55±3.84** 3.42±0.65 108.35±25.34* 94.06±17.85 7 122.12±734.33花椒 4.2 22.71±3.80* 5.21±0.74* 173.99±33.33 128.52±24.59 7 260.68±590.38干姜 7.0 23.55±3.79* 5.41±1.10** 216.55±52.01** 140.87±28.51* 7 029.75±489.63肉桂 3.5 24.24±1.79* 5.06±1.11* 211.35±48.72* 133.53±31.50 7 844.78±690.55怀菊花 7.0 15.48±2.05* 3.76±0.30 99.56±22.62** 93.81±14.09 7 698.85±917.36

表7 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠AMPK 信号通路的影响 (±s,n=3)Table 7 Effects of Chrysanthemi Flos and typical cold-heat traditional Chinese medicine on AMPK signaling pathway in normal rats (±s,n=3)

组别剂量/(g·kg-1) AMPKα/β-actin p-AMPKα/β-actin对照 — 1.000±0.000 1.000±0.000黄芩 7.0 0.997±0.025 0.812±0.115*干姜 7.0 0.975±0.016 1.207±0.044**怀菊花 7.0 0.986±0.021 0.754±0.086**

4 讨论

中药四气理论反映了药物对人体阴阳盛衰、寒热变化的作用倾向，是中药性味归经研究的核心和主体内容，已成为当前药性研究的主要着眼点和切入点[18-20]。药性（气）可通过不同途径以主要影响机体的能量和物质代谢，进而影响药物疗效或副作用发生的一类生物学效应[21]。有研究发现胰岛素能通过AMPK 通路调控犊牛肝细胞脂代谢紊乱[22]。降糖消渴颗粒能够通过调节AMPK 信号通路，改善糖尿病大鼠骨骼肌胰岛素抵抗，并能促进脂肪酸氧化，调节脂肪代谢[23]。亚甲蓝可以通过激活AMPK 信号通路增强线粒体功能，改善细胞能量水平[24]。

图1 怀菊花及典型寒热中药对正常大鼠AMPK 信号通路关键蛋白的影响Fig.1 Effects of Chrysanthemi Flos and typical cold-heat traditional Chinese medicine on key proteins of AMPK signaling pathway in normal rats

图2 怀菊花及各典型寒热中药的热图Fig.2 Heat map of Chrysanthemi Flos and typical cold-heat traditional Chinese medicine

AMPK 在真核生物中广泛存在，是一种在真核细胞中高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。与机体正常的细胞应激、运动、代谢等息息相关，AMPK信号通路的激活主要与增加细胞ATP 消耗和抑制ATP 产生有关[25]。激活的AMPK 信号通路通过调节糖、蛋白质、脂肪代谢，来维持能量在体内的平衡[26]。当细胞营养和能量缺乏时，活化的AMPK信号通路一方面能够抑制糖原、脂肪和胆固醇的合成，减少ATP 的利用；另一方面，能够促进脂肪酸氧化、葡萄糖转运等，增加ATP 的产生[27-28]。通过提高细胞内ATP 储备，应对营养或能量缺乏应激[29]。本实验对AMPK 信号通路的关键蛋白AMPKα、p-AMPKα 蛋白的表达进行检测，发现典型寒性中药黄芩能够抑制p-AMPKα 蛋白的表达，典型热性中药干姜能够促进p-AMPKα 蛋白的表达；怀菊花与寒性中药作用相似，表现出抑制p-AMPKα 蛋白的表达的作用。说明怀菊花能够抑制AMPK 信号通路的激活。

在动物体内，AMPK 信号通路的激活与否主要受机体能量状况的调节。当体内能量被耗竭，细胞内 ATP 水平降低、一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）水平增加时，AMPK 信号通路会被激活。研究也表明，AMP 是AMPK 信号通路的特异性激活剂。AMPK 信号通路被激活后，其作用主要是通过迅速调节一系列作用底物（包括PFK、ACC、HSL、GS 等）的活性从而改变脂肪和碳水化合物代谢来实现的[30]。

机体在健康状态下，体内物质能量代谢处于动态平衡，现代研究表明机体所需要的能量主要是通过糖代谢、脂肪代谢和蛋白质代谢提供。糖代谢是指葡萄糖的有氧氧化，这是机体维持正常生命活动的基本条件，大多细胞都通过此途径获取能量[31]。根据糖氧化分解、释放能量的特点，可将葡萄糖的有氧氧化过程划分为3 个阶段。第1 阶段：葡萄糖氧化生成丙酮酸。HK、PFK-1、PK 是糖酵解途径中的3 个调节位点和关键酶，催化反应均不可逆，这些酶的活性可直接影响糖酵解的速度。在体外纯化的AMPK 可磷酸化PFK，进一步证明AMPK 直接参与了糖酵解的调节。本实验典型寒性药组与怀菊花组HK、PFK-1、PK 水平均降低，说明葡萄糖磷酸化受阻，糖酵解速度减慢，同时由糖酵解产生的能量减少，机体能量代谢被抑制。第2 阶段：丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶A（acetyl-CoA）。丙酮酸需进入线粒体，在PDHC 催化下氧化脱羧，与辅酶A 结合生成乙酰辅酶A[32]。此阶段是糖类经丙酮酸进入三羧酸循环的必经途径。典型寒性药组和怀菊花组PDHC 水平降低，使丙酮酸氧化脱羧反应受阻，乙酰辅酶A 含量降低，三羧酸循环减弱，进而抑制机体能量代谢。第3 阶段：乙酰辅酶A 进入三羧酸循环，氧化、脱羧生成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）+H+、黄素腺嘌呤二核苷酸递氢体（flavine adenine dinucleotide,reduced，FADH2）和CO2，以及少量的ATP；在此阶段中参与代谢的关键酶包括CS、ICD。NADH+H+或FADH2携带的H 通过线粒体内膜上的呼吸链依次传递，最终与氧结合生成水，并释放大量的能量，此阶段中关键酶有CCR、COX、ATPs、ADK。怀菊花组及典型寒性药组CS、ICD、CCR、COX、ATPs、ADK 水平均降低，说明三羧酸循环减弱。三羧酸循环是3 大营养物质氧化分解的共同途径，高效产能并逐步放能。因此，怀菊花组与典型寒性药组均使三羧酸循环减弱，抑制机体的物质能量代谢。

除从食物中得到的葡萄糖外，体内的葡萄糖还可以通过糖原合成和糖异生产生，糖原合成与分解的关键酶是GS、PYGL。能量缺乏时，AMPK 使GS 磷酸化失活，抑制糖原的储备。典型寒性药组与怀菊花组的GS 水平相对于正常大鼠均有所上升，PYGL 水平显著下降，说明糖原合成增加，分解减弱，不能产生6-磷酸葡萄糖，进而无法进入肌细胞糖酵解或葡萄糖的有氧氧化。糖异生是与糖酵解方向相反的代谢途径，可在某些生理、病理情况下，使非糖物质转变成葡萄糖，与糖异生关系密切的酶有PEPCK。实验结果显示，典型寒性药能降低PEPCK 的水平，说明寒性药能抑制机体内非糖物质向葡萄糖的转化。

在机体正常状态下，60%～80%的心肌能量都由脂肪酸氧化提供，与脂肪代谢有关的重要酶有ACC、malonyl-CoA、GK、HSL。肉碱脂酰转移酶-1（carnitine acyl transferase-1，CPT-1）是脂肪酸氧化过程中的一种限速酶，丙二酰辅酶A（malonyl CoA）对其有抑制作用。ACC 催化乙酰辅酶A 合成丙二酸单酰辅酶A，为长链脂肪酸合成提供二碳单位，是脂肪酸合成过程中的限速酶[33]。AMPK 可使ACC磷酸化失活，减少了丙二酰辅酶A 对肉碱脂酰转移酶1 的抑制作用，促进脂肪酸的氧化。本实验中怀菊花抑制AMPK 信号通路的激活，ACC 水平升高，丙二酰辅酶A 的合成增加，从而对CPT-1 抑制增强，脂肪酸氧化减弱。GK、HSL 是脂肪分解的关键酶。一般认为，测定脂肪中的HSL 活性和血液中脂肪酸的浓度，可以反映脂肪分解的情况[34]。本实验寒性药组与怀菊花组GK、HSL 的水平均降低，说明脂肪分解被抑制，怀菊花能够抑制机体脂肪代谢。

与蛋白质代谢有关的重要酶有GDH、HMGR、UCPs。当机体能量不足时，GDH 经变构激活，可加速氨基酸氧化，对机体的能量代谢起着重要的调节作用。本实验寒性药组与怀菊花组GDH 水平降低，蛋白质代谢被抑制。

黄柏、黄连、黄芩是3 味典型寒性中药，干姜、花椒、肉桂是3 味典型热性中药。实验结果显示典型寒性中药能够不同程度地降低正常大鼠肛温、自主活动次数以及PEPCK、PFK-1、PK、PYGL、ICD、PDHC、HSL、GK、HMGR、GDH、UCPs、CCR、COX、ADK、ATPs 的水平，升高malonyl-CoA 的水平，抑制p-AMPK 蛋白的表达；而典型热性中药能够不同程度地升高大鼠肛温、自主活动次数以及PEPCK、PFK-1、PK、PYGL、ICD、PDHC、HSL、GK、HMGR、GDH、UCPs、CCR、COX、ADK、ATPs 的水平，降低ACC、malonyl-CoA 的水平，促进p-AMPK 蛋白的表达。

综上所述，典型寒性中药能够不同程度地抑制正常大鼠的物质能量代谢、抑制AMPK 信号通路的激活；典型热性中药能够不同程度地促进正常大鼠的物质能量代谢、激活AMPK 信号通路。同时，将怀菊花及各典型寒热中药对正常动物影响的结果通过归一化后所得热图发现，怀菊花明显与黄柏、黄连、黄芩寒性中药聚为一类，而干姜、花椒、肉桂热性中药聚为一类，说明怀菊花的作用与典型寒性中药组作用相似，提示怀菊花药性为寒性，这与《中国药典》记载相符。

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