基于网络药理学探索青盐方治疗围绝经期综合征的配伍合理性研究

杨一博，徐 颖，王 璐，樊媛芳，林 娜

中国中医科学院中药研究所，北京 100700

围绝经期综合征是指妇女因卵巢功能衰竭而出现的一系列由雌激素水平下降引起的不适症状，如心悸失眠、血压升高、月经紊乱、烦躁易怒、失眠、骨质疏松等，中医称之为“绝经前后诸症”，经典补肾方剂在临床上具有良好的治疗效果[1]。青盐方源于宋代《圣济总录》，由肉苁蓉、巴戟天、牛膝、蜀椒、青盐组成，5 味药皆入肾经，是补肾益精的经典方剂。肉苁蓉甘咸而温，质地滋腻，性柔而不燥，补肾壮阳之中还兼有强阴润燥、益精之功，为君药；巴戟天辛甘而温，性偏燥而不柔，温阳助火力胜，兼有祛风除湿之力，为臣药；佐以牛膝、蜀椒（花椒），牛膝活血脉、补肝肾，既补且行能引药入肾经，花椒温补脾阳；青盐为使药，能引诸药入肾经，润燥潜降；诸药通过调补肾气阴阳、润燥益精，以达防治绝经前后诸症之功。课题组前期研究表明，青盐方70%乙醇提取物具有雌激素样作用，可促进未成熟小鼠生殖靶器官子宫、阴道的生长发育；还可抑制去双侧卵巢大鼠生殖靶器官萎缩，缓解实验性围绝经期综合征近期焦虑症状和远期骨质疏松症状[2-5]。但对于青盐方治疗围绝经期综合征的组方配伍规律及合理性研究尚不全面。本研究结合青盐方君臣佐使组方特点，采用网络药理学方法，选取各组药中的代表性成分进行分析，对该方的配伍合理性进行初步探究和阐释。

1 材料

中药系统药理学数据库与分析平台（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）数据库（http://tcmspw.com/）、PubChem 数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、UniProt 数据库（http://www.uniprot.org/）、Genecards数据库（https://www.genecards.org/）、OMIM数据库（https://omim.org/）、DisGeNET 数据库（http://www.disgenet.org/）、STRING 数据库（http://string-db.org/）、京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）数据库（http://www.genome.jp/kegg/）、Cytoscape 3.7.1 软件、Rx64 3.6.1 软件、DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）数据库。

2 方法

2.1 药物分组

根据中医方剂君、臣、佐、使的配伍法则及青盐方方解，对青盐方进行以下拆方分组：君药（肉苁蓉）组、君＋臣药（肉苁蓉＋巴戟天）组、君＋臣＋佐药（肉苁蓉＋巴戟天＋花椒＋牛膝）组、君＋臣＋佐＋使药（肉苁蓉＋巴戟天＋花椒＋牛膝＋青盐）组。

2.2 青盐方各拆方组合的化学成分收集与筛选

在TCMSP 数据库中以各中药名称检索青盐方5 味药中所含的化学成分，筛选条件为生物利用度＞30%、类药性＞0.18。结合文献，不满足筛选条件但文献报道明确的有效成分也纳入候选成分。

2.3 青盐方各拆方组合的化学成分潜在作用靶点收集

在TCMSP 数据库中以各中药名称进行检索得到潜在药物靶点。将潜在药物靶点导入UniProt 蛋白数据库，转换为官方名称，在PubChem 数据库搜索青盐主要成分NaCl 所对应的靶点，得到各拆方组合的化学成分相关候选靶点。

2.4 围绝经期综合征疾病的靶点预测

在Genecards数据库、OMIM数据库、DisGeNET数据库查询围绝经期综合征、雌激素低下、围绝经期焦虑、生殖道萎缩、骨质疏松所对应的靶点信息作为疾病靶点信息。

2.5 各拆方组合作用于疾病和各病理时期的靶点预测

采用Rx64 3.7.1 软件统计青盐方各拆方组合与围绝经期综合征疾病和各病理时期的共同靶点，即为作用于围绝经期综合征疾病和各病理时期的作用靶点；将得到的作用于围绝经期综合征的靶点导入STRING 平台获得蛋白质-蛋白质相互作用（proteinprotein interaction，PPI）网络，采用Cytoscape 软件对PPI 网络中的靶点进行拓扑属性分析，筛选出点度中心性和介数中心性均超过平均值的靶点，作为后续分析的关键作用靶点[6]。

2.6 基因本体（geneontology，GO）、通路富集分析和网络构建

通过Cytoscape 软件对筛选得到的关键作用靶点进行GO 富集分析，在结果中选取P＜0.05，排名前10 的项目进行分析[7]。将关键作用靶点输入DAVID 数据库，利用KEGG 数据库，选取P值（P＜0.05）排名前20 的通路进行分析。结合药物化学成分、作用靶点、GO 富集分析和KEGG 富集分析结果，利用Cytoscape 软件制作各拆方组合作用特点网络分析图[8]。

2.7 成分和机制的文献验证

通过检索国内外文献，挖掘分析青盐方相关的活性成分治疗围绝经期综合征的相关机制，为网络药理学所预测的结果提供文献验证。

3 结果

3.1 君药作用特点分析

如表1所示，共得到君药肉苁蓉18个化学成分、240 个靶点。与疾病靶点作交集，得到216 个共有靶点，具体成分及靶点见表2。216 个共有靶点中，204 个与雌激素低下相关、33 个与围绝经期焦虑相关、130 个与生殖道萎缩相关、139 个与骨质疏松有关，共214 个靶点参与了PPI 网络。

对PPI 网络进行拓扑属性分析，点度中心性和介数中心性均超过平均值的关键作用靶点有40 个，分别为C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、谷胱甘肽S转移酶P1（glutathioneS-transferase P1，GSTP1）、Myc 原癌基因蛋白（myc proto-oncogene protein，MYC）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、丝裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、内皮型一氧化氮合酶 3（endothelial nitric oxide synthase 3，NOS3）、转录因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、丝裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、雌激素受体α（estrogen receptor α，ESR1）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）、纤维连接蛋白（fibronectin，FN1）、受体酪氨酸蛋白激酶erbB-2（receptor tyrosine-protein kinase erbB-2，ERBB2）、血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、胰岛素（insulin，INS）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、白细胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、铜锌超氧化物歧化酶1（Cu/Zn superoxide dismutase 1，SOD1 ）、 细胞周期蛋白 B1（G2/mitotic-specific cyclin B1，CCNB1）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、半胱氨酸蛋白酶8（caspase-8，CASP8）、小凹蛋白1（caveolin-1，CAV1）、RAC-α 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、骨桥蛋白（osteopontin，SPP1）、G1/特异性细胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin D1，CCND1）、细胞色素P450酶家族3A4 亚型（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）、趋化因子8（C-X-C motif ligand 8，CXCL8）、雄激素受体（androgen receptor，AR）、蛋白激酶Cα（protein kinase C alpha，PRKCA）、信号传导及转录激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、间隙连接蛋白α-1（gap junction alpha-1 protein，GJA1）、转录因子p65（transcription factor p65，RELA）、血红素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）、过氧化物酶体增殖激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、丝氨酸蛋白激酶（serine-protein kinase ATM，ATM）、前列腺素 G/H 合成酶 2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、原癌基因c-Fos（proto-oncogene c-Fos，FOS），如图1 所示。对关键作用靶点进行GO 富集分析，君药组治疗围绝经期综合征的相关生物过程涉及化学刺激反应、应激反应、生物过程的正负调控、组织发育、细胞过程的负调控、调控细胞增殖、对类固醇激素刺激的反应、细胞凋亡的调节等。排除广泛通路，KEGG通路富集分析结果显示其相关通路主要富集在ER信号通路（涉及9 个靶点）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信号通路（涉及17 个靶点）、MAPK 信号通路（涉及15 个靶点）、缺氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信号通路（涉及14 个靶点）等。

表1 青盐方“中药-化学成分-预测靶点”信息Table 1 Information of “Chinese medicine-active ingredient-predictive target” for Qingyan Formula

表2 青盐方作用于围绝经期综合征的化学成分及靶点信息Table 2 Components and targets information of Qingyan Formula

3.2 君＋臣药组作用特点分析

如表1 所示，共得到君＋臣药组54 个化学成分、288 个靶点。与疾病靶点作交集，得到258 个共有靶点，具体成分及靶点见表2。258 个共有靶点中肉苁蓉18 个化学成分对应216 个靶点，巴戟天39 个化学成分对应116 个靶点。258 个靶点中有243 个与雌激素低下相关（较君药组增加39 个）、38 个有围绝经期焦虑相关（较君药组增加5 个）、147 个与生殖道萎缩相关（较君药组增加17 个）、166 个与骨质疏松有关（较君药组增加27 个），257 个参与了PPI 网络。对PPI 网络进行拓扑属性分析，点度中心性和介数中心性均超过平均值的关键靶点共有47 个，分别为胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，G FA P）、三磷酸腺苷结合盒转运蛋白 G 2（ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、丝裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、巴豆酰基转移酶（histone acetyltransferase p300，EP300）、转录因子Sp1（transcription factor Sp1，SP1）、过氧化酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARA）、HIF1A、SOD1、MMP9、MAPK1、PRKCA、MYC、FOS、RELA、MAPK3、ATM、CXCL8、CCND1、FN1、AKT1、IL-1β、CASP8、CYP3A4、SPP1、JUN、CCNB1、VEGFA、IL-6、ESR1、INS、CAV1、PTGS2、GSTP1、PPARG、AR、CRP、HMOX1、ERBB2、CASP3、NOS3、EGFR、SOD2、STAT3、EGF、IL-2，如图2 所示。对关键作用靶点进行GO 富集分析，君＋臣药组治疗围绝经期综合征的相关生物过程涉及化学刺激反应、调控发育过程、生物过程的正负调控、应激反应、组织增殖、细胞过程正负调控、调控细胞增殖、对类固醇激素刺激的反应等。排除广泛通路，KEGG 通路富集分析结果显示其相关通路主要富集在ER 信号通路（涉及10 个靶点）、PI3K-Akt 信号通路（涉及18 个靶点）、MAPK 信号通路（涉及17 个靶点）、HIF-1 信号通路（涉及16 个靶点）等。

图1 君药组作用特点网络分析Fig.1 Network analysis of pharmacological characteristics of Jun group

图2 君＋臣药组作用特点网络分析Fig.2 Network analysis of pharmacological characteristics of Jun and Chen group

3.3 君＋臣＋佐药组作用特点分析

如表1 所示，共得到君＋臣＋佐药组73 个化学成分、306 个靶点。与疾病靶点作交集，得到274 个共有靶点，具体成分及靶点见表2。274 个共有靶点中肉苁蓉18 个化学成分对应216 个靶点，巴戟天39个化学成分对应116 个靶点，花椒7 个化学成分对应147 个靶点，牛膝16 个化学成分对应170 个靶点。274 个靶点中有258 个与雌激素低下相关（较君＋臣药组增加15 个）、40 个有围绝经期焦虑相关（较君＋臣药组增加2 个）、153 个与生殖道萎缩相关（较君＋臣药组增加6 个）、176 个与骨质疏松有关（较君＋臣药组增加10 个），273 个参与了PPI 网络。如图3 所示，对PPI 网络进行拓扑属性分析，点度中心性和介数中心性值均超过平均值的关节靶点共有48 个，分别为丝裂原活化蛋白激酶8（mitogenactivated protein kinase 8，MAPK8）、细胞色素C（cytochrome C，CYCS）、载脂蛋白A1（apolipoprotein A1，APOA1）、CAT、MMP9、GSTP1、PPARA、AKT1、ESR1、SPP1、NOS3、FOS、SOD2、CCND1、MAPK3、ERBB2、CASP3、CYP3A4、CXCL8、EP300、EGFR、PPARG、AR、GJA1、IL-1β、BDNF、SP1、EGF、STAT3、PRKCA、CAV1、MAPK1、FN1、RELA、ATM、CASP8、JUN、HMOX1、PTGS2、VEGFA、MAPK14、ABCG2、IL-2、IL-6、INS、HIF-1α、MYC、SOD1。对关键作用靶点进行GO 富集分析，君＋臣＋佐药组治疗围绝经期综合征的相关生物过程涉及化学刺激反应、生物过程的正负调控、调控发育过程、细胞过程正负调控、应激反应、细胞凋亡的调节、代谢过程正负调控、组织增殖、对类固醇激素刺激的反应等。排除广泛通路，KEGG 通路富集分析结果显示其相关通路主要富集在ER 信号通路（涉及10 个靶点）、MAPK 信号通路（涉及18 个靶点）、PI3K-Akt 信号通路（涉及18 个靶点）、HIF-1 信号通路（涉及16 个靶点）等。

图3 君＋臣＋佐药组作用特点网络分析Fig.3 Network analysis of pharmacological characteristics of Jun-Chen-Zuo group

3.4 君＋臣＋佐＋使药（全方）组作用特点分析

如表1 所示，共得到君＋臣＋佐＋使药（全方）组74 个化学成分、322 个靶点。与疾病靶点作交集，得到290 个共有靶点，具体成分及靶点见表2。290个共有靶点中肉苁蓉18 个化学成分对应216 个靶点，巴戟天39 个化学成分对应116 个靶点，花椒7个化学成分对应147 个靶点，牛膝16 个化学成分对应170 个靶点，青盐1 个化学成分对应19 个靶点。290 个共有靶点中有273 个与雌激素低下相关（较君＋臣＋佐药组增加15 个）、40 个与围绝经期焦虑相关（较君＋臣＋佐药组未增加）、162 个与生殖道萎缩相关（较君＋臣＋佐药组增加9 个）、182个与骨质疏松有关（较君＋臣＋佐药组增加6 个），288 个参与了PPI 网络。如图4 所示，对PPI 网络进行拓扑属性分析，点度中心性和介数中心性值均超过平均值的靶点共有51 个，分别为趋化因子2（C-C motif chemokine 2，CCL2）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase，G6PD）、尿激酶型纤溶酶原激活物（ urokinase-type plasminogen activator，PLAU）、热休克蛋白A4（heat shock protein A4，HSPA4）、白细胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、CCND1、ATM、MMP9、CYP3A4、EGFR、CXCL8、HIF-1α、PRKCA、PPARG、APOA1、STAT3、ESR1、CASP8、IL-2、CAT、PTGS2、SOD2、JUN、VEGFA、MYC、NOS3、RELA、BDNF、SOD1、CYCS、GSTP1、HMOX1、MAPK3、AR、ERBB2、MAPK14、EP300、FOS、CAV1、EGF、CASP3、MAPK1、IL-1β、MAPK8、SP1、PPARA、FN1、INS、SPP1、AKT1、IL-6。对关键作用靶点进行GO 富集分析，君＋臣＋佐＋使药组治疗围绝经期综合征的相关生物过程涉及化学刺激反应、应激反应、组织发育、生物过程的正负调控、细胞过程正负调控、细胞凋亡的调节、调节细胞增殖、对类固醇激素刺激的反应等。排除广泛通路，KEGG通路富集分析结果显示其相关通路主要富集在ER信号通路（涉及10 个靶点）、PI3K-Akt 信号通路（涉及18 个靶点）、MAPK 信号通路（涉及18 个靶点）、HIF-1 信号通路（涉及16 个靶点）等。

4 讨论

网络药理学涉及生物信息学、计算机科学、网络数据库检索等技术和知识，能预测出药物与通路、疾病的相关性，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，揭示多分子药物协同作用机制，与中药及其复方多成分、多靶点、多途径协同作用的原理契合度较高，因此本研究采用网络药理学方法，将青盐方拆方作用于围绝经期综合征分别进行靶点预测筛选及功能和通路富集分析，探索补肾方剂青盐方治疗围绝经期综合征的作用机制和配伍合理性。

图4 君＋臣＋佐＋使药（全方）组作用特点网络分析Fig.4 Network analysis of pharmacological characteristics of Jun-Chen-Zuo-Shi group

本课题组前期开展的青盐方治疗围绝经期焦虑症的网络分析[4]，为更广泛获得该方治疗该疾病的潜在靶标，结合TCMIP v2.0 和Swiss Target Prediction 得到青盐方45 个化合物对应的455 个潜在靶标信息，并进行初步实验验证。本研究采用TCMSP 数据库中的相关靶点功能，并结合文献发现及知识归纳筛选出青盐方74 个潜在化学成分及322 个潜在靶标信息，旨在从网络药理学角度阐释青盐方防治围绝经期的作用特点及配伍规律。各药可通过多种成分、多个靶点、多种信号通路作用于围绝经期综合征，各药之间既有重复，又互相补充，全方作用于围绝经期综合征的靶点290 个，其中关键靶点51 个，可通过化学刺激反应、应激反应、组织发育、生物过程的正负调控、细胞过程正负调控、细胞凋亡的调节、调节细胞增殖、对类固醇激素刺激的反应等生物过程作用于围绝经期综合征，主要通过影响细胞因子如AKT1、CCND1、凋亡调节剂B 淋巴细胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2），炎症因子如IL-1β、IL-10、CCL2，内分泌因子如BDNF、ESR1、AR 参与神经系统、内分泌系统、免疫系统等，从而作用于围绝经期综合征。KEGG通路富集结果显示，青盐方主要通过ER、PI3K-Akt、MAPK、HIF-1 等信号通路作用于围绝经期综合征。

肉苁蓉作为方中君药，囊括了全方290 个靶点中的216 个靶点，涉及围绝经期焦虑、生殖道萎缩、骨质疏松各个不同症状和雌激素低下关键病理环节。在君药基础上依次增加臣、佐、使药后，靶点个数和各通路所涉及的靶点均有不同程度的增加。君＋臣药组作为方中的核心药对，囊括了290 个靶点中258 个靶点，臣药巴戟天在君药基础上增加了42 个靶点，尤以增加雌激素低下关键病理环节的靶点为最多，也涉及各个不同症状靶点的增加，提示君药、君-臣药对在方中的关键地位，对各个不同症状和雌激素低下关键病理环节均有防治作用。在君臣药对基础上加入佐药花椒、牛膝后，增加了16 个靶点，涉及各个不同症状和关键病理环节均有增加，显示其在方中“佐”的地位。在君、臣、佐药基础上增加使药青盐后增加了16 个靶点，在各个不同时期症状和关键病理环节均有涉及，如血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶（serum/ glucocorticoid-regulated kinase 1，SGK1）[9]、乙酰胆碱转移酶（cholin acetyltransferase，CHAT）[10]涉及神经-内分泌系统；炎症因子高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）[11]、整合素β2（integrin beta 2，ITGB2）[12]涉及免疫、炎症因子；G6PD[13]、15-羟基前列腺素脱氢酶（15-hydroxyprostaglandindehydrogenase，15-PGDH）[14]涉及细胞凋亡；碳酸酐酶1（carbonic anhydrase 1，CA1）[15]、碳酸酐酶2（carbonic anhydrase 2，CA2）[16]涉及骨代谢过程。表明青盐作为引经药，在方中润燥潜降，引诸药入肾经，可关联多个围绝经期综合征涉及的系统及功能，增加君臣佐药组在各个不同症状和关键病理环节的参与防治，起到引经报使的作用。

《素问·上古天真论》云：“女子七岁肾气盛，齿更发长；二七而天癸至，任脉通……时至七七则任脉虚，太冲脉衰少，天癸竭，地道不通，故形坏而无子也。”中医认为妇女时至七七时，肾气衰，天癸竭，进而出现“绝经前后诸症”即围绝经期综合征，故肾虚是致围绝经期综合征之本。课题组前期多项研究发现，补肾方药作用于围绝经期综合征与雌激素网络有着密切联系[2-3,17-19]。雌激素在整个生命过程中影响着雌性丘脑下部的活动，对性分化、发育和成熟均有影响，对骨代谢具有重要调节作用[20-21]。研究表明，方中肉苁蓉、巴戟天、花椒、牛膝均含有雌激素样作用的成分，如槲皮素（quercetin）作为肉苁蓉、花椒、牛膝的共有成分，可与ESR1 结合发挥雌激素样保护作用[22]，并调控雌激素受体下游底物和信号通路，通过雌激素受体介导的通路促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨向分化，改善骨组织结构和功能[23]。MAPK 信号通路可介导卵巢颗粒细胞增殖、分化、迁移、凋亡[24]。HIF-1 信号通路既可促进骨形成和血管形成[25]，又可增加破骨细胞的数量和破骨活性[26]。PI3K/Akt信号通路及其下游靶蛋白可参与骨形成和骨重建过程[27]。ErbB 信号通路可激活PI3K/Akt 途径，促进神经干细胞分化，干预神经系统疾病[28]。调节VEGF 信号通路可改善脑部微循环与脑代谢异常，从而缓解焦虑、抑郁等情况[29]。p53 信号通路参与诱导子宫内膜细胞凋亡[30]，抑制原代海马神经元细胞凋亡[31]。

本研究通过网络药理学方法，分析青盐方中各拆方组合作用于围绝经期综合征的作用靶点及机制，揭示青盐方作用于围绝经期综合征的作用机制及君、臣、佐、使配伍的合理性，为进一步探究其发挥作用的药效物质基础和作用机制提供方向。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突